개발의 초기 단계에서의 해부와 얼룩말 핀치 태아의 다운 스트림 분석
Summary
The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
Abstract
얼룩말 핀치 (Taeniopygia의 guttata)는 독성 1, 2, 문제 3, 메모리를 포함하고 4,5,6 학습 연구의 많은 분야에서 점점 더 중요한 모델 생물이되고있다. 시퀀스 게놈을 가진 유일한 가수로, 얼룩말 핀치 발달 연구에 사용하기 위해 큰 잠재력을 가지고; 그러나, 얼룩말 핀치 개발의 초기 단계는 잘 연구되지 않았습니다. 얼룩말 핀치 개발에 연구의 부족은 작은 계란과 배아를 해부의 어려움에 기인 할 수있다. 다음 해부 방법은 배아 발달의 모든 단계에서 형태와 유전자 발현의 조사를 허용 배아 조직의 손상을 최소화 할 수 있습니다. 이것은 시야를 모두 허용하고 배아의 형광 품질의 영상은, 같은 현장 하이브리드 (ISH), 세포 증식 분석, 이러한 양적 정말이에요 정량적 분석을위한 RNA 추출에서와 같이 분자 절차에 사용L 타임 PCR (qtRT-PCR)를.이 기술은 연구자가 접근하기 이전에 어려웠다 개발의 초기 단계를 연구 할 수 있습니다.
Introduction
이 기술의 전반적인 목표는 개발 연구의 넓은 범위에서 사용하기위한 배아의 초기 단계에서 얼룩말 핀치 (Taeniopygia의 guttata) 배아를 획득하는 것입니다. 얼룩말 핀치 주된 송 버드 모델 생물이되었으며 독성 1, 2, 문제 3, 메모리, 4,5,6, 7,8 비교 신경 해부학을 배우고, 언어 발달 9,10 등 다양한 분야에서 광범위하게 사용되어왔다 . 시퀀스 게놈을 가진 유일한 가수로, 얼룩말 핀치 알려진 조류 11, 12, 13의 50 % 이상을 나타내는 Passeriformes 순서의 분자 유전 연구를 할 수 있습니다.
필드의 다양한 배열의 성인 및 청소년 얼룩말 핀치의 사용에도 불구하고, 몇 가지 연구는 특히 개발 초기 단계에서, 얼룩말 핀치 배아에서 수행되었다. 이것은 그들의 계란의 작은 크기에 기인 할 수있다차 배아, 그리고 닭고기가 (갈 루스 루스 인 domesticus) 이전에 지배적 인 모델 시스템 17,18,19,20,21로 사용하는 연구를위한 모델 생물의 14,15,16 그들의 새로운 상태. 그러나, 비 보컬 학습자로, 닭 보컬 학습, 보컬 학습, 유전, 동작 및 모터 (10)를 학습에 관련된 대뇌 피질 – 기저핵 회로의 개발의 유전 적 기초를 공부에 적합한 모델 시스템이 아닙니다.
그것은 얼룩말 핀치 배아 훨씬 더 섬세하고 더 쉽게 손상 해부 및 분자 과정에서 병아리 배아보다하는 것이 중요합니다. 얼룩말 핀치 배아 permeabilization 단계를 수행 할 때 특히 더주의가 필요합니다. 병아리 배아를 해치지 않을 것이다 강한 세제 효소는 얼룩말 핀치 배아를 손상시킬 수 있습니다. 일반 배려의 측면에서, 그것은 인큐베이터에 배치하기 전에 작은 컵에 얼룩말 핀치 달걀을 넣어하는 것이 필요하다회전 할 때 배양 중에 파손되는 것을 방지하기 위해.
얼룩말 핀치 쉽고 다산 포로 연중 번식, 행동 연구에 순종하고, 보컬 학습자입니다. 이러한 특성은 얼룩말 핀치의 사용은 발전, 유전학 및 언어의 행동 양상을 통합 모델 생물을위한 필요성을 해결하는 것을 허용한다. 얼룩말 핀치 (22)에 특정 최근에 개발 준비 가이드와 함께 아래에 자세히 해부 방법은, 얼룩말 핀치 점점 유용 표준화 된 개발 모델 생물합니다. 그러나, 초기 단계에서 배아를 획득하는 것은 어려운하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자가 쉽게 초기 단계의 배아를 얻을 수 있습니다. 얼룩말 핀치의 복잡한 행동, 또는 다른 작은 개발에 독성 영향의 초기 개발 및 분자 개발 기초 조사 연구, 연작 조류이 절개 방법이 유용합니다.
Protocol
윤리 문 : 방법은 윌리엄과 메리의 대학에서 사육 식민지에서 길 들여진 얼룩말 핀치와 함께 실시했다. 모든 절차는 RSPCA의 가이드 라인 (23)을 따라 윌리엄과 메리의 OLAW (실험 동물 복지 사무소) 동물 복지 보증 (# 1 A3713-01)의 대학에 의해 승인되었고 (# 2013-06 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을했다 – 02-8721 – dacris). 1. 달걀 수집 및 창업 보육 어두운주기 : 14시 10분 빛에 얼룩말 핀치 쌍을 설정합니다. 음식, 물, 건초, 그리고 둥지 상자 임의로 공급. 참고 : 얼룩말 핀치에 대한 일반 관리 및 번식이 잘 (23)를 설명하고있다. 경사 선반 표준 병아리 부화기를 준비합니다. 참고 : 매일 인큐베이터의 바닥에 물을 첨가하여 95 %의 습도 – – 80와 C ° (1 + / -) 37.5에서 인공 부화기를 유지한다. 인큐베이터 이틀 동안 평형을 허용사용하기 전에. 인큐베이터에서 계란을 저장하기에 적어도 2.5 cm 깊이의 작은 공급 컵 (5 × 7.6 cm)를 선택합니다. 아직도 계란이 쉽게 롤을 허용하면서 선은 바닥 및 종이 타월의 2 개의 층을 가진 컵의 아래 가장자리는 컵, 패딩되도록. 인큐베이터의 경사 선반에이 컵을 놓습니다. 참고 : 너무 많은 패딩 롤링을 억제 할 수 인해 쉘 내부에 배아 접착에 성공적으로 부화를 방지 할 수있다. 빛주기의 발병 다음 두 시간 동안 계란을 수집합니다. 참고 :이 부모의 배양에 의한 소정의 배양 시간에 대한 개발 단계의 차이를 최소화 할 수 있습니다. 부드럽게 계란의 길이를 따라 팁과 기지에서 엄지와 집게 손가락으로 계란을 선택합니다. 둥지에서 수집 마련 날짜와 시간에 레이블을 둔 부드러운 4B 흑연 연필을 사용합니다. 참고 : 부드러운 4B 연필 깨지기 쉬운 달걀 껍질을 깨는 연필의 위험을 줄일 수 있습니다. 각 C의 5 표시된 계란 – 1.3.2) 배치 1인큐베이터에서 계란 자유롭게 쉘의 내부에 배아의 부착을 방지하기 위해 롤백 할 수 있도록 최대. 참고 : 한 잔에 5 개 이상의 계란을 배치하면 개별 계란의 흔들림을 방지하고 태아의 생존 능력을 감소시킬 수있다. 난자에서 배아의 2. 제거 , 절개를 준비 다음과 같은 물질 조립하려면 깨끗한 메스, 뾰족한 집게, 두 개의 별도의 뾰족한 집게를. 10 × 10 cm의 절개를 위해 깨끗하고 비 흡수성 표면을 제공하는 해부 범위의 기초에 종이의 무게를 놓습니다. 참고 : 노른자를 쉽게 조작 할 수 있으며 메스 섬세한 막 절단을위한 최고의 표면이기 때문에 무게 용지가 중요합니다. 50 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브에 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)의 분취 량을 준비하고, 적어도 세 가지 전송 피펫와 작은 쓰레기 통을 획득. 배아를 고정하는 경우, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 분취 량을 준비주의 :. PFA 증기는 독성,D PFA와 관련된 모든 단계는 노출을 최소화하는 흄 후드 내부에서 수행되어야한다. 플래시는 배아를 냉동하면, 액체 질소를 획득하고 해부 범위 근처에 보관. 불임이 해부 프로토콜에 대한 문제가되지 않지만 모든 자료가 깨끗한 확인합니다. 얼룩말 핀치 준비 가이드 (22)의 설명에 따라 원하는 단계에 필요한 시점에서 인큐베이터에서 계란을 제거합니다. 참고 : 22 12 배아 (그림 3A) 단계를 해부하는 6 단계의 배아 (그림 4A) (22)를 해부하고 배양 56 시간 후 알을 제거하기 위해 배양 36 시간 후 알을 제거합니다. 광섬유 조명 램프를 사용하여 내부를 조명하는 계란을 통해 수직 축에 빛나는 빛을 따라 그것을 잡고 계란을 촛불. 계란 뒤에 빛의 끝을 놓고 노른자와 배아를 찾습니다. 노른자 반대 측면에 메스를 위치에 끝에서 계란을 따라 절단희미한 압력 기본. 조심스럽게 엄지 손가락과 집게 손가락으로 계란의 팁과 기초에 압력을가하거나, 부드럽게 집게로 잘라 함께 껍질을 따로 올리하여 계란의 내용을 제거합니다. 노른자가 부드럽게 구르고 있도록 직접 무게 종이 위의 계란을 엽니 다. 배아 발달을 둘러싸고있는 희미한 흰색 링으로 볼 수 있으며 태아가 중앙에 위치하도록 여분의 벌금을 사용하여 노른자 집게를 기울 방향 접합의 흰색 영역의 노른자를 검사합니다. 참고 : 노른자의 표면에 희미한 흰색 원이 관찰되지 않는 경우, 미세 집게을 부드럽게 배아는 노른자 위에 때까지 노른자위를 통해 롤. 참고 : 단계의 경우 1 – 9 (22), 배아 디스크는 직경이 6 mm 미만이며, 노른자의 표면에 희미한 약간 불투명 디스크로 볼 수 있습니다 – 참조 그림 1을 참조하십시오. 단 10 세 이상 22, 혈액 풀을 향상 V에게 허용배아의 isibility하지만,이 어려운 배아의 위치를 만들면서, 난황을 천공하지 않도록주의하십시오. 여분의 배아 조직에서 배아의 3. 분리 압력 (그림 1B)를 해소하기 위해 노른자의 가장자리에 구멍을, 그리고 배아 디스크와 함께 노른자 지름의 길이에 걸쳐 하나의 상처를 확인합니다. 배아를 포함하는 노른자의 섹션이 성공적으로 (그림 1B)로 구분 될 때까지이 대각선 라인을 만드는 반복합니다. 주의 :이 단계는 난황 질량이 본래대로 할 수 있지만 배아 구조물의 손상을 방지 배아 주위 절단시 노른자의 표면에 감압 더 정밀도 허용한다. 전송 피펫으로 노른자의 가장자리를 제거합니다. 가능한 한 많은 노른자를 제거하지만 배아 무게 종이와 눈물의 건조한 표면에 부착되지 않도록 소량을 남겨 참고. 도포를하여 배아 디스크를 세척배의 바닥을 향해 45도 각도로 1X PBS를 주입. 다음에이 아니라 위에서 배아 디스크 전송 피펫의 팁을 놓으십시오. 추가 노른자 요구 사항이 제거 될 경우, 페트리 접시에 배아를 전송하기 전에 무게를 종이에 메스 어떤 노른자를 분리합니다. 참고 :이 방법은 무게 종이의 표면에서 배아를 제거합니다. 작은 플라스틱 배양 접시에 1X PBS의 최소한의 볼륨과 함께 전송 피펫을 사용하여 배아를 전송합니다. 배아에 직접하지 페트리 접시에 더 많은 1X PBS를 추가하고 근처 1X PBS 떨어지는, 그러나에 의해 배아를 씻으십시오. 페트리 접시 전송 피펫으로 폐기물 1X PBS를 씻어 제거 잔류 노른자, 페트리 접시를 기울하고 제거하는 소용돌이 친다. NOTE : 1X PBS를 제거하면 플라스틱 표면이 잔류 1X PBS와 함께 미끄러 때문에, 배아 일반적 배양 접시의 바닥에 부착하지 않는다. 배아 접시 붙어 그러나 더 1X PBS를 첨가 할 수있다. 만약 고정 t그는 배아 단계 3.5 및 3.6을 따릅니다. 플래시 배아를 냉동 경우, 즉시 3.8 단계로 이동합니다. 현장 하이브리드 화에 대한 배아를 고정하는 경우, 즉시 배아를 잠수함 페트리 접시에 4 % PFA를 추가합니다. 평평하게하기 위해 배아의 상단에 직접 4 % PFA 드립; 이 컬링에서 배아를 방지 할 수 있습니다. 12 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 배아를 수정. 고정 후, 등급 메탄올 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 (메탄올) 솔루션과 저장소에있는 배아를 탈수. 배아 단계 1 사이에 있으면 – 8 22 배에 부착 된 난황 막 제거합니다. 주의 :이 단계는 정착 동안 또는 후에 수행 될 수있다. 그들은 난황 막에 부착하기 때문에 스테이지 (8) 22 세 미만의 태아는 쉽게 그림 2A에서 볼 수있는 것처럼 키 구조를 모호하게 가시화되지 않습니다. 그립 여분의 미세 집게와 접합의 영역을 넘어 확장 멤브레인의 가장자리. Carefully 잔류 난황 과립을 씻어하고 난황 막에 배아 디스크의 준수를 느슨하게 여러 번에 배아를 플립. 참고 :이 배아 구조를 손상시킬 수로, 배아의 중심을 만지지 마십시오. 간격이 접합의 영역과 난황 막 사이에 나타나지 않는 경우, 부드럽게 여분의 벌금 접합 영역이 난황 막에서 느슨하게 집게를 밀고 스크래치. 그립 여분의 벌금 난황 막 집게를 스쳐 부드럽게 떨어져 배아에서 당깁니다. 필요한 경우, 부드럽게 접합의 영역에서 배아 디스크의 주연을 그립에 의해 멀리 난황 막에서 배아를 잡아 당깁니다. 제거 후 생물 1 폐기물 (바이오 안전성 레벨 1)에서 난황 막 폐기하십시오. 병아리 배아 (24, 25)에 대한 표준 전체 마운트 ISH 프로토콜을 따라야하지만, 다음과 같은 제안을 고려, 젊은 배아 단계에 ISH 분석을 실시합니다. <ol> , ISH의 절차를 수행하는 동안 태아의 손상을 줄이고 각각의 배아에 대한 스크류 캡으로 한 5 ㎖ 유리 병을 사용하십시오. 배아가 완전히 침수되는 것을 보장 용액 3 ㎖ – 만 2 병을 채우십시오. Nutate 병 수직 스티로폼 랙 (또는 보안 튜브를 유지합니다 어떤 랙)에 5 ㎖의 유리 병을 배치하여 nutator에 고정된다. 참고 :이주의 사항은 수평 장동 동안 유리 병의 뚜껑에 접촉 할 때 발생할 수있는, 찢어진되는 배아를 방지 할 수 있습니다. 배아 단계를 0 – 6 22, 실온에서 5 분 1X PTW 5 ㎍ / ㎖의 단백질 분해 효소 K로 처리. 배경 염색을 줄이기 위해 37 ° C에서 10 분 동안 1X PTW 12 22 10와 ㎍ / ㎖의 단백질 분해 효소 K를 – 배아는 7 단계적 치료. 12 시간 동안 10 ㎍ / ml의 프로브 농도로 배양, 10 (22) – 1 단계에서 유전자 발현의 낮은 수준을 검출하기 위해 충분한 발색 반응을 생성한다. 이전 단계의 경우, 1 & #로 배양956, 60 ℃에서 g / ㎖ 프로브 농도 해부 다음 페트리 접시에 3 ㎖의 1X PBS와 난황 과립에서 배아를 분리 배양 접시를 기울 – 플래시 냉동 배아는 빠르게 2를 추가합니다. 액체를 제거하고 2 반복 – 모든 노른자를 제거하기 위해 3 번. 잘 사용하면 C. -80 ° 저장하기 전에 미리 표시 microcentrifuge 관과 액체 질소에 플래시 동결 포셉, 전송 배아를 기울 4. 에듀 세포 증식 분석. 법인 설립 및 얼룩말 핀치 배아 에듀 감지. 배아 또는 노른자를 찾기 위해 광섬유 조명 램프를 사용하여 계란을 촛불. 배아 미세 주입 공정 중에 손상되지 않도록 난자 내의 배아 또는 난황의 위치를 알 반대측의면을 표시한다. 라인 원하는 방향으로 계란을 보유하는 그릇 모양의 점토와 곰팡이를 가진 60mm 플라스틱 접시. 표시된 지점이 있어야한다미세 조작기를 사용하여 마이크로 인젝션 용 바늘의 삽입을 허용하도록 지향. 참고 : 점토가 미세 주입하는 동안 단계 4.11에서 배양을 통해 계란을 안정됩니다. 두 개의 유리 모세관 미세 주사 바늘을 빼냅니다. 표시된 지점에 달걀에 구멍을 찌를 하나의 바늘을 무디게. 미네랄 오일로 backloading 및 microinjector에 삽입하여 주입 제 마이크로 인젝션 용 바늘을 준비한다. microinjector에 59.8 NL에 주입 당 발표 솔루션의 볼륨을 설정합니다. 10 mM의 주식 에듀 솔루션을 미세 주사 바늘을 넣습니다. 쉘을 무너 뜨리거나 달걀 공동으로 쉘의 조각을 드롭하지 않도록주의하면서 무딘 유리 모세관로 표시된 자리에서 껍질에 구멍을 만듭니다. 구멍이 미세 주사 바늘이 노른자 또는 태아에 구멍을 통해 직접 삽입 할 수 있도록 45도 각도가되도록 계란의 방향. 미세 조작기를 사용하여 삽입약 1.0 cm 구멍으로 바늘을로드. 직접 개발 배아 또는 노른자위에 에듀 솔루션의 원하는 양을 주입. 참고 : EDU 478 NL의 최대 배아 사망을 초래하지 않고 주입 할 수있다. 즉시 계란 부화하는 동안 태아의 탈수를 방지하기 위해 접시를 커버하는 플라스틱 포장의 여러 계층과 계란과 점토 홀더를 포장. 플라스틱 테이프 가장자리가 배양 중에 풀기에서 플라스틱을 방지하기 위해 접시의 바닥에 포장. 참고 : 플라스틱 포장은 해부하기 전에 즉시 제거해야합니다. 원하는 단계에 도달 할 때까지 새로 증식하는 세포가 37 ° C에서 알을 배양하여 에듀를 통합 할 수 있습니다. 주사 후, 인큐베이터에있는 선반을 기울이기로 계란을 반환하지 않습니다. 인큐베이터 안에 안정된 표면에 플라스틱 포장 점토 늘어선 접시를 놓습니다. 플라스틱 포장을 제거하고 상기 프로토콜 다음 배아를 해부하다.4 % PFA의 배아를 수정하고 상술 한 바와 같이 4 ° C에서 12 시간을 배양한다. 고정 후, 추가 분석 할 때까지 -20 ° C에서 신선한 100 % EtOH로 5 분 및 저장을위한 100 % 에탄올 (EtOH로)로 세척. 5. 에듀 반응 프로토콜을 "클릭" 다음 단계는 모든 유리 병에서 수행됩니다. 다음의 연속 5 분 세척과 배아를 재수 : EtOH로 75 % EtOH로 25 % 살균 탈은 25 % EtOH로 75 % 1X PTW, 100 % 1X PTW (SDD) 물, 50 % EtOH로 50 %의 SDD의 증류수 10 분마다 100 % 1X PTW에 세 번 씻으십시오. 구 부분 10X 콘텐츠 버퍼 용액 (10 μL)의 한 부분을 결합하여 반응 완충액 첨가제 (키트 부품 F)를 희석하여, 물 (90 μL)을 SDD. 혼합하여 별도의 관에서의 반응 믹스를 준비 다음 100 ㎕의 희석 반응 버퍼 첨가제 875 μL 1X PBS 20 μL CuSO 4, 5 ㎕의 아 지드를.참고 : 반응 혼합물의 부피가 축소 될 수있다. 배아가 완전히 반응 혼합물에 포함되는 경우 반응이 작동합니다. 사용 직전에 희석 된 반응 버퍼 첨가제 (단계 5.3)를 추가합니다. 이후의 모든 단계는 어둠 속에서 수행됩니다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 배아를 커버. 알루미늄 호일로 바이알을 커버하고 nutator 부속 스티로폼 랙에 배치하여 2 시간 동안 실온에서 세로로 배양한다. 10 분마다 신선한 1X PBS에서 배아를 3 회 반복한다. 4 ℃에서 하룻밤 신선한 4 % PFA의 배아를 품어 4 ° C에서 신선한 1X PBS에서 10 분 각각의 저장소에 대한 1X PBS로 3 회 세척 추가 분석을 할 때까지 호일로 배아를 커버.
Representative Results
난황 막 (A)에 부착 노른자 (B)에서 배아를 분리하는 적절한 방법을 설명하면서 그림 1에 도시 된 단계는 배아의 모양을 나타냅니다. 태아는 난황 막에 비해 훨씬 가볍고 접합의 영역을 식별 할 수 있습니다. 노른자는 버려야 될 때까지 배아 자체는 구별하기 어려운 경우가 많습니다. 배아는 난자에서 해부되면, 고정 할 수 있습니다 또는 플래시는 나중에 사용하기 위해 냉동. 현장 하이브리드의가 해부 배아에 계획되어있는 경우,이 접합의 영역을 통해 태아에 부착 난황 막 제거 할 필요가있다.이 막은 (C) 제거되면 2 배의 향상된 가시성을 보여줍니다 그림, 그리고 난황 막 (A, B)를 벗겨하는 적절한 방법. 해부 및 고정 후, 전체 현장 하이브리드에 탑재 그림 3 (A, A ', B, B에서와 같이 실시 하였다') 및 그림 4 (A, A', B, B ')와 그림 5 (A, B, C) orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 발달 메틸 수은의 낮은 복용량에 노출 된 배아 (의 Otx2) 발현의 차이를 감지하기 위해. 5는 그림 센스 조사 결과, 배경의 시연 부족. 제어 배아는 6 22 (A, 무대 위해 개발하는 동안 그림 4, 같은 시점에서 알 해부에도 불구하고, 발달 메틸 수은 (메틸 수은)에 노출 된 태아는 5 단계 22 (B, B ')으로 진행 '). 해부 그림 4와 같이 배아의 그룹은 둥지에서 수집하고 같은 시간에 인큐베이터에서 촬영했다. 일부 천연 변이는 개발에 존재하더라도, 이전의 해부 된 데이터에 근거하여, 인큐베이터에서 온도 변동은 2.4 ppm으로 메틸 배아가 develo의 원인이 될 것 같지는 않다pmentally 지연. 단계에서의 차이는 발달 메틸 수은에 노출 된 배아에서 세포 증식의 변화를 나타냅니다. 해부하기 전에, EDU는 하루 2 알에 주입하고 밤새 배양시켰다. 스테이지 (16) (22) 태아의 해부 및 고정 후, EDU는 그림 6 (A, B, C)에서와 같이 증식하는 세포의 검출을 허용, 화학을 "클릭"을 사용하여 시각화 하였다. 그것은 개발 진행을 방해 할 수 메틸 수은에 노출로, 인큐베이터 및 해부하는 동안 계란을 배치하거나 EDU 분석을 수행 할 때주의 깊게 시점을 모니터링하는 것이 중요합니다. 초기 주입 단계 1.3에 지정된 컬렉션의 날이었다 0 일에 실시 하였다. 이 배아는 약 38 시간 후 (7 단 22) 해부했다. 생존율만큼 분사량 478 NL 하에서되면서 약 90 % (대조군의 배아와 같은 비율)로 밝혀졌다. <p class="jove_content는">이 절개 방법은 고품질의 RNA를 추출 할 수 있습니다. 단계 16 22 배아를 해부 한 후, RNA 추출은 그림 7에서 볼 수있는 것처럼, 더 최적화가 필요로 제조 업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 난황 막의 제거는 RNA 추출 및 저장 QRT-PCR의 응용 프로그램에 대한 필요했다. 참고 : 전방 및 후방 지역은 각각 이미지의 상단과 하단에 있도록 모든 배아 수치가 지향하고 있습니다. 그림 1. 얼룩말 핀치 배아를 찾기 및 해부 절차는 1-10 22 스테이지. 희미한 흰색 디스크 (A) 알 수있을 때까지 부드럽게 노른자를 압연하여 배아를 찾습니다. 일단배아는 노른자의 중심에 위치하고 있으며, 노른자는 첫 번째 컷 (1) 이후의 인하 (2) 인 접합 (ZJ)의 영역을 국경 난황 막 압력을 완화 단계적으로 (B)의 해부 난황 막에 부착. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 난황 막과 배아 구조의 가시성의 그림 2. 제거. 4 % PFA를 포함하는 페트리 접시에 노른자에서 배아의 제거, 장소 배아 다음과 같습니다. 동일계 하이브리드 화를 수행 할 필요가있는 경우, 배아 구조의 시인성이 필수적이며 난황 막 (A)를 제거함으로써 달성 될 수있다. 그립 여분의 벌금 난황 막 집게를 밀고하고 필요한 경우 부드럽게, 바깥 쪽 가장자리에 직접적으로 배아를 처리하여 멀리 배아를 벗겨(B). 난황 막 제거는 배아 구조의 선명도를 증가하고, 배아는 현장 하이브리드 (C)에 몇 군데 나 처리 할 수 있습니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3. 전체 마운트 현장 하이브리드에이 발달 orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 (의 Otx2)의 메틸 수은. 발현 패턴에 노출 얼룩말 핀치 배아에서 수행은 0.0 ppm으로 메틸 수은 (A, A ')와 2.4 ppm으로 메틸 수은 (B, B에 노출 된 배아를 특징으로했다 ') 부모의 다이어트를 통해. 할 일rsal (A)과의 Otx2의 복측 (A ') 표현은 치료 그룹의 배아가 동일한 시점에서 해부 하였다. 스테이지 (12) (22) 중에 중뇌 및 광섬유 소체 전체에 표시되지만 발달 (B) 등쪽에서 본 지연된 무대 11 22 약어의 특징 인 헤드 구조의 복부 (B ')보기 :. MB, 중뇌; 영업 이익, 눈 소포. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 그림 4. 전체 마운트 원래의 장소에 하이브리드가 발달 orthodenticle의 호 메오 박스 (homeobox) 2 (의 Otx2)의 메틸 수은. 발현 패턴에 노출 얼룩말 핀치 배아에서 수행은 6 단계 22 엠브리 특징으로했다 OS는 0.0 ppm으로 메틸 수은 (A, A ')와 단계 2.4 ppm으로 메틸 수은 (B, B에 노출 5 22 배아'부모의 다이어트를 통해)에 노출. 약어 : 오전, 중배엽의 전연; 아니, 척색, 척색 중배엽; PO, proamnion, 전방 blastopore; PS, 원시 행진 22. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 그림 5. 전체가 현장에서 마운트 하이브리드가 감지 프로브를 사용하여 얼룩말 핀치 배아에서 수행. (A) 5 단계 22 배아. (B) 초기 단계 6 22 배. (C) 단계 11에서 22 배. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 6 "SRC ="/ files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/> 그림 6. 에듀 설립 얼룩말 핀치 배아 드 tection. 에듀 화학이 스테이지 (16) 22 배아 (A, B, C)에서 증식하는 세포를 감지하는 데 사용했다 "클릭". EDU는 티미 딘 (26, 27)의 위치에 DNA에 통합되고, 클릭 화학 (27)를 사용하여 감지됩니다. 대량 살상 무기 확산은 somites의 측면 모서리 및 tailbud에서 명확하게 볼 수 있습니다. 패널 A는 태아의 후방에 독점적으로 발생 확산을 보여주고 개별 증식 세포를 보여줍니다. 패널 B는 전체 배아의 증식 위치를 보여줍니다. 패널 C는 전방 지역을 보여주고, 더 자세히에서 높은 증식 telencephalon (TE)를 보여줍니다. 요약 : AF, 양수 배; FLB, 앞다리 봉오리; HLB, 뒷다리 봉오리; 르, 렌즈 소포; MS, 중뇌; MT, metencephalon; OPC, 눈 컵; PA, 인두 아치; SM, 체절 중배엽; 결핵, tailbud; 테, telencephalon. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 해부 얼룩말 핀치 배아. 제어 (0.0 ppm)를 1.2 ppm으로 메틸 수은의 배아에서 추출한 RNA의 그림 7. 품질은 해부 단계 3.8의 설명에 따라 플래시가 동결되었다. 각 레인은 각 치료 그룹에서 두 균질화 된 배아에서 추출한 RNA를 보여줍니다.
Discussion
배아 준비 가이드 (22)와 게놈 주석의 최근 발전은 얼룩말 핀치 개발 연구를위한 바람직한 모델 생물합니다. 그러나, 단계 1에서 3-7밀리미터 범위 얼룩말 핀치 배아의 작은 크기와 취약성 – 10 22, 11, 14 해부 어렵게 만들 수 있습니다. 위치과 청결 노른자의 표면에서 배아를 제거하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 절차를 수행하기 위해 충분한 세부 사항을 제공한다. 이 프로토콜은 성공적으로 절개를 보장하기 위해 일반적으로 알려져 있지 않습니다 만, 필요한 중요한 단계를 보여줍니다. 예를 들어, 배아 및 나와 배제 용지의 무게의 시트 사이 노른자의 작은 층을 남겨두기 위하여 필수적이다.
배아의 식별 및 제거 모두 어려울 수 있습니다. 이 후 난황의 표면에 배아를 식별 해결하기 위해, 직접 노른자 위에 빛을계란에서 제거하고 배아를 찾기 위해 45 ° 각도로 노른자보고되었습니다. 배아가 위치한되면, 배아를 찢어지지주의하면서 종이의 무게에 노른자를 잘라.
구조의 더 나은 시각화를 위해 8 22 – 추가 응용 프로그램은 해부학 현장 하이브리드의 차이, 또는 세포 증식 시험 법에 대한 이미지를 포함하는 경우는 1 단계에서 난황 막 제거하는 것이 중요합니다. 초기 단계에서 노른자 또는 난황 막 제거 할 때 문제가 발생하는 경우, 배아 취약성을 줄이기 위해 1X PBS로 세척하기 전에 4 % PFA의 배아를 수정. 설명 된대로 첫 해부 동안 난황 막을 제거함으로써, 구조 현장 하이브리드의를 수행 한 후 명확하게 얼룩말 핀치 배아에 보이는 그대로입니다.
EDU의 한계는 배아 사망에 478 NL 리드에 투여 볼륨의 관리입니다. 그러나 광대 한 복용량 범위는 varyin 수 있습니다증식 세포 태그의 g 수준.
이 키트에 사용되는 "클릭"반응은 구리 (I) – 촉매 – 알킨 – 아 지드 – 사이클로 (구리 (I) AAC)입니다. 이러한 특정 반응에서, 알킨 함유 티미 딘 아날로그 분자 (EDU)가 적극적으로 셀을 분할하여 통합된다. 듀의 알킨 그룹 DNA의 나선 구조로부터 돌출 한 자유 알킨 그룹에 바인딩 녹색 형광 분자에 접합 지드 분자에 노출에 의해 검출된다. 녹색 형광 배아에서 새로 증식하는 세포를 보여줍니다. 이러한 반응 종은 생물에 자연적으로 존재하지 않기 때문에 아 지드의 바이오 직교성과 알킨 그룹이 아닌 특정 얼룩을 방지 할 수 있습니다. DNA가 발생하는 반응의 순서 변성 할 필요가 없으므로, 상기 DNA 의존성 분석은 쉽게 27을 행할 수있다.
이 방법의 고유 제한은 작은 크기와 파편입니다얼룩말 핀치 배아의 ility. 주의 수행이되지 않을 경우 15 22 손상 배아 구조가 발생할 수 있습니다 – 배아의 난황 막 제거 1 단계입니다. 그러나이 프로토콜은 조사자 이전 깊이 연구되지 않은 구조적 기형 및 유전자 발현을 조사하는 초기 배아 단계를 사용할 수 있도록 절개 방법을 단순화한다. 이 프로토콜은 수사관 성인 표현형의 발달 기원을 확인 할 수 세포 분자 분석의 과다에 대한 방법을 엽니 다. 예를 들어, 유전자 발현은 다양한 환경 조건에서 보컬 학습에 연루 또는 개발 28, 29,30,31의 초기 단계에서 약물 치료를 다음 검사 할 수있을 것이다. 이 글에서 설명하지 않지만,이 방법은 잠재적으로 얼룩말 핀치 조직 섹션과 일렉트로 / OV에 대한 현장 하이브리드의 방사성 등의 절차를 허용O 수술 32, 33, 34. 얼룩말 핀치 문학의 광대 한 본문 내에서 중요한 모델 생물로 설립 된 것을 감안할 때, 이러한 연구는 성인 생리학과 행동 발달 메커니즘을 연결 언어 7, 9의 특히 발전에 숨은 기회를 제공합니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자신의 자금 출처, 윌리엄과 메리의 대학 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 과학 교육 프로그램을 감사한다; 보조금 스폰서 : NIH (MSS) 허가 번호 : R15NS067566. 또한 동물 보호에 대한 지원은 예술과 과학의 윌리엄 앤 메리 대학 생물학과 대학에서 지원을 인정합니다.
Materials
| Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
| 7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
| Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
| Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Ethanol (EtOH) | |||
| 50mL Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
| Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
| Modeling Clay | Any brand | ||
| Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
| Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
| Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20 | |||
| 35mL Plastic petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| plastic wrap | Any brand | ||
| Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
| Reaction Mix: 875μL 1xPBS, 100mM 20μL CuSO4 (Kit Component E), 5μL Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100μL diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
| sdd H2O | |||
| Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
| Stainless steel scalpel | |||
| Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
| 4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
| Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 4×4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
Riferimenti
- Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. Early exposure to 2,2′,4,4′,5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches. Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).
- Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata). Chemosphere. 90, 125-131 (2013).
- Maney, D. L., Goodson, J. L. Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds. Adv Genet. 75, 83-119 (2011).
- Kirn, J. R. The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning. Brain and Language. 115, 29-44 (2010).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).
- Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning. PLoS One. 6, (2011).
- Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).
- Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch. Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).
- Jarvis, E. D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).
- Brainard, M. S., Doupe, A. J. Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research. Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).
- Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches. J Physiol Paris. , (2012).
- Warren, W. C., et al. The genome of a songbird. Nature. 464, 757-762 (2010).
- Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).
- Birkhead, T. R., et al. Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).
- Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
- Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival. Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).
- Stern, C. D. The chick; a great model system becomes even greater. Dev Cell. 8, 9-17 (2005).
- Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins. Brain Research. 1424, 67-101 (2011).
- Tickle, C. The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development. Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Development. 7, (2012).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).
- Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata. J Morphol. , (2013).
- Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. , (2001).
- Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue. Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).
- Pizard, A., et al. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).
- Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling. Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).
- Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata). Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).
- Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch. Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).
- Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus. Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).
- Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites. The Auk. 127, 156-161 (2010).
- Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes. PLoS One. 7, (2012).
- Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities. The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).
Citazione di questo articolo
Murray, J. R., Stanciauskas, M. E., Aralere, T. S., Saha, M. S. Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development. J. Vis. Exp. (88), e51596, doi:10.3791/51596 (2014).