ऊतक ट्राइएज और कंकाल मांसपेशियों की बीमारी के मॉडल के लिए ठंड
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
कंकाल की मांसपेशी, क्योंकि कार्यात्मक सेलुलर, आणविक, और रोग मूल्यांकन से इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए ऊतक संग्रह के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की आवश्यकता है जो इसकी संरचना और समारोह की एक अद्वितीय ऊतक है. जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के लिए कंकाल की मांसपेशी जब मूल्यांकन कारण जन्मजात पेशी विकारों और इन सुविधाओं की मान्यता के मामले में हस्तक्षेप करने के निर्धारण के लिए क्षमता में देखा कुछ रोग असामान्यताओं का सूक्ष्मता के लिए, स्थिर मांसपेशियों के रोग मूल्यांकन तय पेशी के लिए बेहतर है. अन्य ऊतकों जब ठंड आमतौर पर इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं कि ऊतकीय परीक्षा के लिए कंकाल की मांसपेशी ठंड साथ ही, जब मांसपेशियों में गंभीर ठंड कलाकृतियों का उत्पादन करने की क्षमता विशिष्ट सावधानियों की आवश्यकता है. इस पांडुलिपि के इष्टतम कंकाल की मांसपेशी आकारिकी की रक्षा करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा isopentane (2 methylbutane) का उपयोग कंकाल की मांसपेशी की तेजी से ठंड के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. यह प्रक्रिया भी च के लिए प्रभावी हैआनुवंशिक या प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए करना ऊतक reezing. इसके अलावा, हम इकट्ठा करने के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रयास पर ध्यान देने के साथ भी (1) एक फाइबर कार्यात्मक अध्ययन और (2) myoblast सेल संस्कृति के लिए ऊतक की अल्पावधि ट्राइएज के लिए पसंदीदा विधियों का वर्णन है कि एक व्यापक प्रक्रिया है, में हमारे ठंड प्रोटोकॉल एकीकृत है ऊतक और इन अध्ययनों को पूरा करने के लिए विशेष अनुसंधान या संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए परिवहन. कुल मिलाकर, इस पांडुलिपि ताजा ऊतक को प्रभावी ढंग से प्ररूपी अध्ययन की एक किस्म के लिए वितरित किया जा सकता है की एक रूपरेखा प्रदान करता है और इस तरह जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी से संबंधित रोग के अध्ययन के लिए मानक संचालन प्रक्रिया (रियायतों) प्रदान करता है.
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
कंकाल की मांसपेशी एक संरचनात्मक और कार्यात्मक अनूठा ऊतक है, और विशेष तैयारी की प्रक्रियाओं संरचनात्मक और कार्यात्मक मापदंडों के इष्टतम आकलन की अनुमति आवश्यक है. ऊतकों की एक किस्म आमतौर पर नैदानिक और अनुसंधान संदर्भों में रोग के अध्ययन के लिए जमे हुए हैं, वहीं गैर मांसपेशियों के ऊतकों के लिए ठंड प्रोटोकॉल आमतौर पर ठंड से पहले अक्टूबर में ऊतक की कुल विसर्जन शामिल है. 3 चित्र में दिखाया गया है, इस तरह के एक प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशी के रोग मूल्यांकन के लिए अनुपयुक्त है और अभी तक यह एक अधिक सामना करना पड़ा त्रुटि है कि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल को काफी समान है. इस पत्र के लक्ष्य के लिए इस तरह के मुद्दों से बचने के लिए मांसपेशियों के समुचित से निपटने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदान करना है. सलाह भी मामलों में बाहर कोर प्रयोगशालाओं द्वारा उच्च गुणवत्ता वाले डेटा के अधिग्रहण को सुविधाजनक बनाने के प्रयास में परोक्ष शारीरिक और सेलुलर अध्ययन के लिए मांसपेशियों के समुचित से निपटने पर संकलित किया गया है wheपुन साइट पढ़ाई बेहतर या संभव नहीं हैं.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, रोग के अध्ययन के लिए मांसपेशियों की उचित प्रसंस्करण में बिल्कुल जरूरी है कि तत्वों, ऊतक के पानी की मात्रा को कम करने की मांसपेशी में जमे हुए है, जिस पर तापमान कम है, और ठंड हासिल की है जिस गति से बढ़ रही है शामिल हैं. ऊतक या (तरल नाइट्रोजन के साथ सामना करना पड़ा है के रूप में अपर्याप्त तापमान से या ठंड एजेंट और ऊतकों के बीच सीधे संपर्क का अभाव, द्वारा उत्पादित) जमने की प्रक्रिया का अत्यधिक सुस्ती के भीतर अत्यधिक नमी रोग विश्लेषण ख़राब कर सकते हैं कि कलाकृतियों ठंड को बढ़ावा मिलेगा. अक्टूबर ऊतक नमी का एक अतिरिक्त स्रोत प्रदान करता है, कई प्रयोगशालाओं एक embedding सब्सट्रेट के रूप में गोंद Tragacanth जैसे अन्य चिपकने का उपयोग करें. यहां तक कि ठंड उचित प्रदर्शन किया है जिन मामलों में, देखभाल आरटी कंटेनर या उपकरणों के साथ संपर्क के माध्यम से बाद में गलती से विगलन नमूनों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.इस प्रकार, एक सफल जमने की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा करने के लिए सभी उपकरणों और कंटेनर के एक पूर्व द्रुतशीतन भी शामिल है कि योजना का एक डिग्री की आवश्यकता है. ठंड कलाकृतियों का सामना कर रहे हैं, तो सबसे रोग मूल्यांकन के लिए पर्याप्त है कि ऊतक की वसूली के लिए यहाँ वर्णित एक विधि है. हालांकि, इस फ्रीज / पिघलना चक्र सही ऊतक विज्ञान की पेशकश और (फिर से फ्रीज ऊतक के लिए आवश्यक समय के अलावा) ऊतक के अन्य आणविक या एंजाइमी पढ़ाई ख़राब करने की क्षमता है, तो उचित प्रारंभिक ठंड प्रथाओं का उपयोग बेहद पसंद किया जाता है नहीं है . ठंड विरूपण साक्ष्य पूर्व जमी ऊतक पर सामना करना पड़ा है जहां मामलों में, हालांकि, इस के साथ साथ वर्णित तकनीक बेहद उपयोगी हो सकता है.
ईएम पूर्व ऊतक संग्रह करने के लिए योजना बनाने की आवश्यकता है कि विशिष्ट तकनीकी चुनौतियों की पेशकश कर सकते हैं के लिए ऊतक के फिक्सेशन और प्रसंस्करण. EM के लिए नमूनों को एकत्रित करते समय सबसे आम त्रुटि glutaraldehyd के लिए भी मोटी हैं कि ऊतक टुकड़े का उपयोग शामिल हैई घुसना. Glutaraldehyde केवल एक सतह दिया, देखभाल से मांसपेशियों के ऊतकों में लगभग 0.1 सेमी प्रवेश के रूप में उन्हें नमूनों में से एक आयाम कोई मोटा 0.2 सेमी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. ईएम सीधे सिकुड़ा तंत्र के मूल्यांकन का एक बहुत अच्छा साधन है के रूप में इसके साथ ही, कुछ जांचकर्ताओं रणनीति विकसित किया है मांसपेशी पूर्व निर्धारण के लिए पूर्व तनाव या पूर्व खिंचाव एक physiologically प्रासंगिक तनाव में सिकुड़ा तत्वों की माप की अनुमति देने के लिए. वहाँ पूर्व कसने के लिए कोई मानक प्रोटोकॉल है, लेकिन दो रणनीतियों संक्षेप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. यह वे एक बहुत ही विशेष तरीके से किया जाता है, और यह एक गैर मानक के माध्यम से sarcomere लंबाई में artifactual परिवर्तन को रोकने में सुस्त राज्य में मांसपेशियों को ठीक करने के लिए बेहतर हो सकता है, जब तक मांसपेशियों में अप्रत्याशित परिणाम उत्पन्न कर सकते पूर्व tensioning करने का प्रयास करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए पूर्व कसने प्रक्रिया 8,9. ऐसे विशिष्ट माप सबसे बी सहित (आवश्यक नहीं कर रहे हैं, जिसमें मांसपेशियों के लिएनैदानिक प्रयोजनों के लिए किया iopsies), मांसपेशियों में तनाव पूर्व के प्रयासों में आम तौर पर नहीं बने हैं, और मांसपेशियों आकारिकी पर मुख्य प्रभाव मांसपेशी में sarcomeres की एक गैर वर्दी रिक्ति है.
इस पत्र में जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के क्षेत्र में परीक्षण के प्रदर्शन के लिए रियायतों प्रदान करने के लिए एक श्रृंखला में पहली बार प्रतिनिधित्व करता है, और यह नियमित रूप से सेलुलर, आणविक, कार्यात्मक, शारीरिक प्रदर्शन कि जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के क्षेत्र में 20 से अधिक विशेषज्ञों के प्रयासों का प्रतिनिधित्व करता है, और रोग अनुसंधान. प्रकाशित रियायतों की एक श्रृंखला की आगामी वर्ष से अधिक उपलब्ध कराया जाएगा, और प्रत्येक के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल और उचित प्रकाशन प्रारूपों इस शराबी प्रयास का लक्ष्य प्रदान करना है वॉशिंगटन डीसी में 2013 के अप्रैल में आयोजित एक जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के कंसोर्टियम कार्यशाला में चर्चा की गई 1) एम के रूप में हमारे क्षेत्र में इस्तेमाल किया प्रथाओं और endpoints के प्रमाण के अनुसार जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के क्षेत्र में आवश्यक परीक्षण और नमूनों के विश्लेषण के लिए एक रोडमैपसंभव है, और के रूप में uch 2) हमारे क्षेत्र में नए शोधकर्ताओं के लिए मानक प्रथाओं पर शिक्षा प्रदान करते हैं. हम इन संसाधनों हमारे अधीन अध्ययन क्षेत्र में नए जांचकर्ताओं के प्रवेश की सुविधा है और इस तरह का प्रदर्शन किया जा सकता है कि अनुसंधान के दायरे में सुधार होगा. इसके अतिरिक्त, प्रथाओं का एक मानकीकरण अध्ययनों में आंकड़ों की तुलना करने के लिए और preclinical और नैदानिक परीक्षणों की योजना बना और जब प्रदर्शन endpoints की पहचान करने के लिए अत्यंत उपयोगी हो जाएगा.
इस लेख का मुख्य फोकस पढ़ाई की एक किस्म के लिए उपयुक्त ठंड और ऊतकों की तैयारी से संबंधित है, जबकि हमारे सहयोगी समूह भी पेशी नमूनों के रोग विश्लेषण के लिए उपयोगी endpoints पर चर्चा की. वर्तमान में, वहाँ रोग विश्लेषण करते समय लेने के लिए दृष्टिकोण पर कोई आधिकारिक आम सहमति है, और विभिन्न अध्ययनों की एक किस्म प्रत्येक संबंधित बीमारी के लिए पूर्व प्रकाशन के लिए नए निष्कर्ष संबंधित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. इस प्रकार, हम यह करने के लिए उपयोगी होगा कि सोचापेशी विकृति के लक्षण वर्णन में रोग endpoints की योजना बनाने के लिए कुछ सामान्य दिशा निर्देशों का प्रस्ताव. पिछले एक अध्ययन में विकृति बढ़ाता, काफी सोचा) 1 में फाइबर आकार माप की विधि रखा जाना चाहिए, 2) फाइबर प्रकार विशिष्ट असामान्यताएं या उपचार के प्रभाव की संभावना, 3) असामान्यताएं या प्रभाव की संभावना सीमित कर रहे हैं कि व्यक्ति की मांसपेशियों के लिए, और 4) के एक अध्ययन के तहत बीमारी के लक्षण हैं कि रोग निष्कर्षों बढ़ाता के लिए एक रणनीति. फाइबर आकार सबसे अध्ययन के लिए एक आवश्यक समापन बिंदु है, और दुर्भाग्य से यह मात्रा निर्धारित है कि कैसे में व्यापक भिन्नता है. कई अध्ययनों से मालिकाना इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की स्वचालित मात्रा का ठहराव तरीकों का उपयोग कर इन परिणामों की रिपोर्ट, लेकिन इन कार्यक्रमों में से कई इन स्वचालित माप गलत प्रदान कर सकते हैं (जैसे फाइबर हलकों या ellipses हैं संभालने के रूप में) शॉर्टकट ले. यह इन स्वचालित प्रोग्राम उनके माप ख कैसे समझ लेना जरूरी हैefore माप में विश्वास रहा है, और हम कागज तरीकों में इन विवरण शामिल करने के लिए जांचकर्ताओं प्रोत्साहित करते हैं. इसके अतिरिक्त, फाइबर आकार निरूपित किया जाता विशिष्ट माप अत्यंत चर रहा है, और कुछ माप दूसरों 10,11 करने के लिए बेहतर हैं. फाइबर आकार का आमतौर पर इस्तेमाल किया माप शारीरिक अध्ययन के प्रदर्शन जांचकर्ताओं अपने उपकरणों का उपयोग कर प्राप्त सीएसए माप के लिए उनके परिणामों के मानकीकरण, विशेषकर इसलिए क्योंकि फाइबर पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) है. सीएसए माप सही सही अनुप्रस्थ वर्गों में फाइबर आकार को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जबकि दुर्भाग्य से, वे (अनुदैर्ध्य या तिरछे से sectioned फाइबर कृत्रिम रूप से उच्च सीएसए माप होगा कि सीमा तक) फाइबर उन्मुखीकरण पर बड़े पैमाने पर निर्भर कर रहे हैं और फाइबर आकार के लिए इस प्रकार आदर्श नहीं नाप रहे हैं. फाइबर पार के अनुभागीय क्षेत्र पर कम निर्भर है कि फाइबर आकार का एक बेहतर माप वीं की माप है जो न्यूनतम Feret व्यास (MinFeret व्यास), हैपेशी सेल 12 में ई नाबालिग व्यास. इस माप फाइबर उन्मुखीकरण पर केवल थोड़ा निर्भर है और आम तौर पर फाइबर माप के लिए नैदानिक सोने का मानक है, और जांचकर्ताओं इस तकनीक के उपयोग की ओर ले जाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है. इन मापों अक्सर सीएसए माप 13 उत्पन्न करता है कि एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है, और भी मैन्युअल मापने के लिए सीधा कर रहे हैं कर सकते हैं. फाइबर प्रकार, विशिष्ट मांसपेशी, और विशिष्ट रोग से संबंधित रोग निष्कर्षों के संदर्भ में के अनुसार रोग डेटा का मूल्यांकन करने के लिए सम्मान के साथ, ये तो बस एक अध्ययन की योजना बनाने के दौरान विचार किया जाना चाहिए कि कम विवादास्पद मुद्दे हैं. फाइबर प्रकार immunohistochemical या ATPase धुंधला का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन यह विशिष्ट मांसपेशियों और जानवरों की प्रजातियों इन फाइबर प्रकार के विशिष्ट मिश्रण (इस प्रकार विभिन्न उम्मीदों की जरूरत महसूस और रणनीतियों के परीक्षण) है कि विचार करने के लिए उपयोगी है. स्नायु विशिष्ट रोग भागीदारी या उपचार प्रभावकारिताहोते हैं, और कुल मांसपेशी वजन नियंत्रण की तुलना में विकृतिविज्ञानी मूल्यांकन करने के लिए मांसपेशियों पर निर्णय लेने से पहले बीमारी की विविधता की डिग्री की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सकते हैं. अंत में, यह अच्छी तरह से कई मांसपेशियों की बीमारियों (जैसे nemaline मायोपथी में nemaline छड़ के रूप में) विशिष्ट रोग असामान्यताएं 14,15 के साथ जुड़े रहे हैं जाना जाता है, और इसलिए यह इन असामान्यताएं एक फाइबर प्रकार या मांसपेशी में पाए जाते हैं कि क्या विचार करने के लिए भी उपयोगी है विशेष वितरण विश्लेषण 16,17 जब प्रदर्शन. हम पेशी के मूल्यांकन के लिए मानकों का एक कड़ा सेट प्रस्ताव नहीं है, जबकि कुल मिलाकर, हम इन मुद्दों पर पहले किसी भी कंकाल की मांसपेशी रोग में रोग के अध्ययन के प्रदर्शन के लिए विचार किया जाना चाहिए कि विश्वास करते हैं.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
Riferimenti
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