Elastin-liknande polypeptider är stimulans-lyhörd biopolymerer med applikationer från rekombinanta proteinrening till drug delivery. Detta protokoll beskriver rening och karakterisering av elastin-liknande polypeptider och deras peptid eller proteinfusioner från Escherichia coli med hjälp av deras lägre kritisk lösningstemperatur fasövergång beteende som ett enkelt alternativ till kromatografi.
Elastin-liknande polypeptider är repetitiva biopolymerer som uppvisar en lägre kritisk lösningstemperatur fasövergång beteende, befintliga som lösliga Unimers under en karakteristisk övergångstemperatur och aggregering i mikrometerstorlek koacervat ovanför deras övergångstemperatur. Utformningen av elastin-liknande polypeptider på genetisk nivå medger exakt kontroll av deras sekvens och längd, som dikterar sina termiska egenskaper. Elastin-liknande polypeptider som används i en mängd olika tillämpningar, inklusive biosensing, vävnadsteknik, och läkemedelsavgivning, där övergångstemperaturen och biopolymeren arkitekturen i ELP kan avstämmas för den specifika tillämpningen av intresse. Dessutom är den lägre kritiska lösningstemperaturen fasövergång beteende elastin liknande polypeptider tillåter deras rening genom deras termiska respons, så att deras selektiva koacervation och resolubilisering möjliggör avlägsnandet av både lösliga och olösliga kontaminants efter expression i Escherichia coli. Denna metod kan användas för rening av ensamma eller som en reningsverktyg för peptid-eller proteinfusioner där rekombinanta peptider eller proteiner genetiskt bifogats elastin-liknande polypeptid taggar kan renas utan kromatografi elastin-liknande polypeptider. Detta protokoll beskriver rening av elastin-liknande polypeptider och deras peptid eller proteinfusioner och diskuterar grundläggande karakterisering tekniker för att bedöma den termiska beteende rena elastin liknande polypeptidprodukterna.
Elastin-liknande polypeptider (ELPS) är biopolymerer som består av den repeterande pentapeptiden VPGXG där X, gäst rest, är vilken aminosyra som helst utom prolin. ELPs uppvisar lägre kritisk lösningstemperatur (LCST) fasomvandling beteende, så att en homogen ELP lösningen separera i två faser vid upphettning till dess LCST, som ofta kallas för den inversa ningstemperatur (T ^) i ELP litteratur 1. De två faserna består av en mycket utspädd ELP globule fas och en ELP rik sedimentfasen. ELP rika sediment bildas på en kort tidsskala vid aggregering av ELP-kedjorna i micron stora partiklar som sedan smälter samman. Detta inträffar över ett område av några få grader Celsius och är vanligtvis reversibla, som en homogen lösning utvinnes efter återgång till en temperatur under T ^.
ELPs är oftast syntetiseras i Escherichia coli (E. coli) from en artificiell gen som ligeras in i en expressionsplasmid. Denna plasmid transformerades därefter i en E. coli-cellinje som är optimal för proteinuttryck. Vi har uteslutande används T7-lac pET-vektorsystem för expression av en stor variation av ELPs i E. coli, fastän andra uttryckningssystem i jäst 2-4, svampar 5, och växter som 6-8 har också använts av andra forskare. Ett antal metoder finns för att genetiskt konstruera repetitiva ELP-gener, inklusive rekursiv riktad ligering (RDL) 9, rekursiv riktad ligering av plasmid rekonstruktion (pre-RDL) 10, och överlappar förlängning rullande cirkel amplifiering (OERCA) 11. Förmågan att konstruera ELPs på genetisk nivå ger möjlighet att använda rekombinanta DNA-tekniker för att skapa ELPs med olika arkitekturer (t.ex., monoblock, diblocks, trisegment etc), vilken kan läggas ytterligare med funktionellapeptider och proteiner. Kontroll på genetisk nivå säkerställer också att varje ELP uttrycks med den exakta längden och sammansättningen betingade av genetiska plasmid mall, som ger perfekt monodisperse biopolymera produkter.
De termiska egenskaperna för varje ELP bero på parametrar inneboende till biopolymeren såsom dess molekylvikt (MW) och sekvensen, samt yttre faktorer inklusive dess koncentration i lösning och närvaron av andra cosolutes, såsom salter. Längden av ELP 12 och dess gäst återstoden komposition 1, 13, 14 är två ortogonala parametrar i ELP konstruktion som kan användas för att styra T t, där hydrofoba gästrester och längre kedjelängder ger lägre T ^ s, medan hydrofila gästrester och kortare kedjelängder ger högre T T S. ELP koncentration är omvänt relaterad till T-T, där lösningar av greater ELP koncentration har lägre t t s 12. Den typ och koncentration av salter påverkar också ELP Tt, där effekten av salter följer Hofmeister-serien 15. Kosmotropic anjoner (Cl – och högre på Hofmeister-serien) sänker ELP T t och ökande saltkoncentration förstärker denna effekt. Dessa inre och yttre parametrar kan ställas in för att erhålla termiska beteende inom ett mål-temperaturområde som krävs för en specifik tillämpning av en ELP.
Stimulus-responsiv beteende ELPs är användbar för en mängd olika tillämpningar, inklusive biosensing 16, 17, vävnadsteknik 18 och läkemedelstillförsel 19, 20. Dessutom, när ELPs är fuserade till peptider eller proteiner på den genetiska nivån, kan ELP tjäna som en enkel reningsmarkör för att tillhandahålla en billig satsmetod för rening av rekombinant peptidvatten eller proteiner som inte kräver någon kromatografi 21. Modifiering av reningsprocessen säkerställer att aktiviteten av peptiden eller proteinet sammansmält med ELP bibehålls. Peptid-eller protein ELP-fusioner kan renas för applikationer där ELP-taggen är användbar 22, 23 eller alternativt, när det krävs fri peptid eller protein, kan en proteasigenkänningsställe införas mellan peptiden eller proteinet och ELP. Borttagning av ELP-taggen kan sedan uppnås genom uppslutning med gratis proteas eller ett proteas ELP fusion, där den senare ger det ytterligare lättare bearbetning som en sista omgång av ELP rening kan separera ELP-taggen och proteas ELP fusion från målet peptiden eller proteinet i ett enda steg 24, 25. Följande protokoll beskriver förfarandet för ELPs och peptid eller protein ELP-fusioner rening genom sina termiska egenskaper och diskuterar grundläggande tekniker för att karakteriseraden termiska respons av ELP produkter.
ELPs erbjuda ett billigt och kromatografiska fria medel för rening med utnyttjande av deras stimulans svarande fasbeteende. Detta tillvägagångssätt drar fördel av LCST beteende ELPs och peptid-eller protein ELP-fusioner för att eliminera både lösliga och olösliga föroreningar efter expression av genetiskt kodade ELPs i E. coli. Denna enkla rening kan användas för att producera ELPs för en mängd olika tillämpningar, eller kan utnyttjas för rening av rekombinanta peptider eller proteiner i vilka ELP kan agera som en reningsmarkör som kan tas bort med efterreningsbehandling.
ELP rening innebär förberedande steg för att lysera E. coli och ta bort iska och olösliga cellfragment från den råa kulturen lysatet (Figur 1), följt av avlägsnande av kvarvarande lösliga och olösliga föroreningar från ITC (Figur 2). Centrifugering efter utlösning ELP övergången av ytterligarening av värme eller saltet separerar ELP från lösliga föroreningar i supematanten, i ett steg benämns en varm spinn. Efter resolubilizing ELP, lösningen centrifugerades igen vid en temperatur under T ^ för att avlägsna den olösliga kontaminant pellet, i ett steg benämns en kall spinn. Omväxlande varma och kalla spins förbättrar renheten för ELP lösningen med varje cykel, till en liten kostnad för att ge. Renings utbytena varierar beroende på ELP T t, längd och fuserade peptider eller proteiner. Normalt ger detta protokoll 100 mg renat ELP per liter E. coli-kultur, men avkastningen kan nå upp till 500 mg / L. Den slutliga renheten hos ELP produkt bekräftas genom SDS-PAGE (fig 3). Den MW av det renade ELP ska matcha ett nära samarbete med den teoretiska MW kodas av ELP-genen. Men vissa ELPs migrerar i SDS-PAGE med en skenbar molekylvikt på upp till 20% högre än den förväntade MW 9, 27. Mer exakt analys av ELPMW kan uppnås genom MALDI-TOF-MS, vilket också kan ge ytterligare information om renhet ELP produkten tillsammans med ortogonala analytiska tekniker såsom högpresterande vätskekromatografi (HPLC).
Efter rening är ELP T t mäts av temperaturprogrammerad turbidimetri. Denna teknik övervakar OD av en ELP lösning medan temperaturen ökas. The T t är koncentrationsberoende så är det lämpligt att karakterisera en koncentrationsserie relevant för den avsedda tillämpningen av ELP. För ELP homopolymerer turbiditeten profil uppvisar en enda skarp ökning som motsvarar den ELP övergången från Unimer till mikrometerstorlek aggregat (Figur 4A). The T t definieras som den temperatur som motsvarar inflektionspunkten i grumlighet profilen bestämmas exakt som den maximala av den första derivatan av OD i förhållande till temperaturen. Den reversibilitetELP fasövergång bekräftas av en minskning i OD till baslinjen som temperaturen sänks under Tt (Figur 4B). Den grumlighet profil med ökande och minskande temperaturramper kommer att skilja sig åt i storlek och kinetik grund av sedimente av ELP koacervat och variabel hysteres i ELP resolubilisering. Peptid eller protein ELP-fusioner på liknande sätt uppvisar LCST uppträdande på detta sätt, där peptiden eller proteinet sammansmält med ELP påverkar T t. För protein ELP-fusioner övergången är reversibel under smälttemperaturen hos proteinet. Medan temperaturprogrammerad turbidimetri är en utmärkt metod för den inledande termisk karakterisering av ELP-produkter, alternativa tekniker, såsom differentiell svepkalorimetri (DSC), kan också användas för att mäta den ELP Tt.
ELPs med mer komplexa arkitekturer uppvisar mer komplicerade termiska beteenden som också kan kännetecknas av temperatur-programmed turbidimetri. ELP disegmentsampolymerer, till exempel, uppvisar ett karakteristiskt grumlighet profil som motsvarar deras temperatur-utlöst självorganisering till sfäriska miceller vid deras kritiska micellization temperatur. För sådana ELP disegmentsampolymerer OD ökar vanligtvis först 0,1-0,5 enheter ovanför baslinjen indikerar övergången från Unimers till miceller, varefter en kraftig ökning av OD (upp till 2,0 enheter över baslinjen) vid en högre temperatur indikerar bildandet av mikrometerskala aggregat (Figur 5A). Ytterligare information om temperatur-utlöst själv monterade ELP strukturer erhålls med DLS, en teknik som mäter R H av ELP-aggregat i lösning. Förändringar i R H överens nära med förändringar i OD mätt med turbidimetri (Figur 5B). ELP Unimers uppvisar normalt en R H <10 nm medan nanopartiklar församlingar uppvisar ett R H ~ 20-100 nm och aggregat uppvisar en R H </sub >> 500 nm. Ytterligare information om egna sammansatta ELP nanopartiklar, t.ex. aggregering nummer och morfologi, kan erhållas genom statisk ljusspridning eller kryogen transmissionselektronmikroskopi 17, 23, 29.
På grund av avstämbarhet av ELP termiska egenskaper, är ett urval av T t s erhålls genom olika ELP mönster. Det är viktigt att hålla i minnet att det inneboende T t kommer att påverka optimeringen av reningsprotokollet för varje ELP, där extremt låg eller hög T T S kräver mest modifiering av denna standardprotokoll. ELPs med extremt höga övergångstemperaturer kan vara olämpliga för rening med detta tillvägagångssätt. Om konstruktionen av nya ELPs och peptid eller protein ELP-fusioner kan äventyra den termiska respons av ELP, kan en enkel histidinmärkning inkluderas för alternativ rening genom immobiliserad metall affinitetskromatografi. Dessutomegenskaper ELP sekvensen kan kräva modifiering av detta protokoll om gästen återstoden debiteras. Manipulering av pH kan användas som en metod för att ändra den totala laddningen av ELP i ett försök att eliminera elektrostatiska interaktioner med föroreningar 17. Dessutom är lämplig för den särskilda omständighet av ELP fusioner med peptider och proteiner när lämpliga åtgärder vidtagits för att säkerställa reningsprocessen inte störa aktiviteten hos den sammansmälta delen detta protokoll. Anteckningar hela protokollet om sådana ändringar tjänar till direkt rening av ELPs som kan presentera dessa utmaningar med avseende på T t, laddning, eller fusions oro.
Reningen av ELPs medelst deras LCST beteende presenteras en enkel och kromatografi fritt tillvägagångssätt för att rena huvuddelen av ELPs och peptid-eller protein ELP fusioner uttrycks i E. coli. Protokollet sammanfattas här tillåter rening of ELPs i en enda dag med hjälp av utrustning som är gemensamma för de flesta biologiska laboratorier. Lättheten att reningen av ELPs och deras fusioner kommer, hoppas vi, uppmuntra ett ständigt växande mångfald av ELP mönster för nya tillämpningar inom materialvetenskap, bioteknik och medicin.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NSF: s Research Triangle MRSEC (DMR-1.121.107).
pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels. |
Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |