Elastin-lignende polypeptider er stimulus-responderende biopolymerer med ansøgninger fra rekombinant protein oprensning til drug delivery. Denne protokol beskriver oprensning og karakterisering af elastin-lignende polypeptider og deres peptid eller protein fusioner fra Escherichia coli ved hjælp af deres lavere kritiske løsning temperatur faseovergang adfærd som et simpelt alternativ til kromatografi.
Elastin-lignende polypeptider er gentagne biopolymerer, der udviser en lavere kritisk opløsningstemperatur faseovergang adfærd, eksisterende som opløselige unimers under en karakteristisk overgangstemperatur og aggregering i mikron-skala koacervater over deres overgangstemperatur. Udformningen af elastin-lignende polypeptider på det genetiske niveau tillader præcis styring af deres sekvens og længde, som dikterer deres termiske egenskaber. Elastin-lignende polypeptider anvendes i en lang række applikationer, herunder biosensorer, tissue engineering, og drug delivery, hvor overgangen temperaturen og biopolymer arkitektur ELP kan indstilles til den konkrete anvendelse af interesse. Endvidere er den nedre kritiske opløsningstemperatur faseovergang adfærd elastin-lignende polypeptider tillader deres oprensning ved deres termiske reaktion, således at deres selektive coacervation og resolubilization tillader fjernelse af både opløselige og uopløselige kontaminants følgende udtryk i Escherichia coli. Denne fremgangsmåde kan anvendes til oprensning af elastin-lignende polypeptider alene eller som en rensning værktøj til peptid-eller protein-fusioner, hvor rekombinante peptider eller proteiner genetisk vedlagt elastin-lignende polypeptid-tags kan oprenses uden chromatografi. Denne protokol beskriver oprensning af elastin-lignende polypeptider og deres peptid-eller proteinfusioner og diskuterer grundlæggende karakterisering teknikker til at vurdere den termiske opførsel af rene elastin-lignende polypeptidprodukter.
Elastin-lignende polypeptider (ELPS) er biopolymerer sammensat af den gentagne pentapeptid VPGXG hvor X, gæsten rester, er en hvilken som helst aminosyre bortset fra prolin. ELPS udviser lavere kritiske opløsningstemperatur (LCST) faseovergang adfærd, såsom at en homogen ELP løsning adskilles i to faser ved opvarmning til dets LCST, som almindeligvis kaldes den inverse glasomdannelsestemperatur (T t) i ELP litteratur 1. De to faser består af en meget fortyndet ELP klump fase og en ELP rig sediment fase. ELP rige sediment er dannet på en kort tidshorisont ved sammenlægning af ELP kæderne i micron mellemstore partikler, der efterfølgende flyder sammen. Dette sker over et område af nogle få grader Celsius og er typisk reversible, som en homogen opløsning genvindes ved at vende tilbage til en temperatur under T t.
ELPS syntetiseres typisk i Escherichia coli (E. coli) from et kunstigt gen, som er ligeret ind i et ekspressionsplasmid. Dette plasmid transformeres derefter ind i en E. coli-cellelinie, som er optimal for protein-ekspression. Vi har udelukkende anvendes T7-lac pET vektor-system til ekspression af et stort udvalg af ELPS i E. coli, selv om andre ekspressionssystemer i gær 2-4, svampe 5 og planter 6-8 også er blevet anvendt af andre forskere. En række metoder eksisterer for at genetisk konstruere gentagne ELP gener, herunder rekursive retningsbestemt ligatur (RDL) 9, rekursive retningsbestemt ligation af plasmid genopbygning (Pre-RDL) 10, og overlapper udvidelse rullende cirkel forstærkning (OERCA) 11.. Evnen til at konstruere ELPS på det genetiske niveau giver mulighed for at anvende rekombinante DNA-teknikker til at skabe ELPS med forskellige arkitekturer (f.eks monoblocks, diblokke, triblokke, etc.), som yderligere kan tilføjes med funktionellepeptider og proteiner. Kontrol på det genetiske niveau sikrer også, at hver ELP udtrykkes med den nøjagtige længde og sammensætning dikteret af dens genetiske plasmidtemplate, hvilket giver perfekt monodisperse biopolymer produkter.
De termiske egenskaber af hver ELP afhænge af parametre, der er karakteristiske for biopolymeren såsom dets molekylvægt (MW) og sekvensen, såvel som ydre faktorer, herunder dets koncentration i opløsning, og tilstedeværelsen af andre cosolutes, såsom salte. Længden af ELP 12 og gæst rest sammensætning 1, 13, 14 er to ortogonale parametre i design ELP, der kan anvendes til at styre T t, hvor hydrofobe gæst rester og længere kædelængder resultere i en lavere T t s, mens hydrofile gæst rester og kortere kædelængde resulterer i højere T t sek. ELP koncentrationen er omvendt relateret til T-t, hvor opløsninger af gr.eater ELP koncentration har lavere T t s 12. Typen og koncentrationen af salte indflydelse også ELP T t, hvor effekten af salte følger Hofmeisterserien 15. Kosmotropic anioner (CL – og højere på Hofmeister serien) sænke ELP T t og stigende saltkoncentration forstærker denne effekt. Disse interne og eksterne parametre kan indstilles for at opnå termisk adfærd inden for et mål temperaturområde, der kræves til en bestemt anvendelse af en ELP.
Stimulus-reagerende adfærd ELPS er nyttigt for en bred vifte af applikationer, herunder biosensorer 16, 17, tissue engineering 18, og drug delivery 19, 20. Derudover, når ELPS fusioneres til peptider eller proteiner på det genetiske niveau, kan ELP tjene som en simpel rensning tag for at tilvejebringe en billig batch fremgangsmåde til oprensning af rekombinant peptidevand eller proteiner, der ikke kræver kromatografi 21. Ændring af rensningsprocessen sikrer, at aktiviteten af peptidet eller proteinet fusioneret til ELP opretholdes. Peptid-eller protein ELP fusioner kan oprenses til anvendelser, hvor ELP tag er nyttigt 22, 23 eller alternativt, når det frie peptid eller protein er påkrævet, kan et proteasegenkendelsessted indsættes mellem peptidet eller proteinet og ELP. Fjernelse af ELP tag kan derefter opnås ved fordøjelse med gratis protease eller en protease ELP fusion, hvor sidstnævnte giver den ekstra nem behandling som en sidste runde af ELP oprensning kan adskille ELP-tag og protease ELP fusion fra målet peptid eller protein i et enkelt trin 24, 25. Følgende protokol beskriver proceduren for ELPS og peptid eller protein ELP fusioner rensning ved deres termiske egenskaber og diskuterer grundlæggende teknikker til karakteriseringden termiske reaktion ELP produkter.
ELPS tilbyder en billig og kromatografi-fri midler til rensning ved udnyttelse af deres stimulus-responderende fase adfærd. Denne fremgangsmåde drager fordel af LCST adfærd ELPS og peptid-eller protein ELP fusioner til at fjerne både opløselige og uopløselige urenheder efter ekspression af genetisk indkodede ELPS i E. coli. Denne lette oprensning kan anvendes til fremstilling af ELPS til en lang række applikationer, eller kan udnyttes til oprensning af rekombinante peptider eller proteiner, hvor ELP kan virke som en rensning tag, der kan fjernes med post-rensning forarbejdning.
ELP rensning involverer indledende skridt til at lysere E. coli og fjerne genomisk og uopløselige cellerester fra den rå kultur-lysat (figur 1), efterfulgt af fjernelse af resterende opløselige og uopløselige urenheder ved ITC (figur 2). Centrifugering efter udløsning ELP overgang ved tilsætningtion af varme eller saltet udskilles ELP fra opløselige stoffer i supernatanten i et trin betegnes en varm spin. Efter resolubilizing ELP opløsningen centrifugeret igen ved en temperatur under T t for at fjerne uopløselige kontaminant pellet i et trin kaldes en kold spin. Skiftende varme og kolde spin forbedrer renheden af ELP opløsning med hver cyklus, på en lille pris at give. Oprensningsudbytter variere efter ELP T t, længde og fusionerede peptider eller proteiner. Typisk er denne protokol giver 100 mg renset ELP per liter E. coli kultur, men udbyttet kan nå op til 500 mg / L. Den endelige renhed ELP produkt bekræftes ved SDS-PAGE (figur 3). MW af det oprensede ELP skal matche tæt sammen med den teoretiske MW kodes af ELP genet. Men nogle ELPS vandrer ved SDS-PAGE med en tilsyneladende MW på op til 20% højere end den forventede MW 9 27. Mere præcis analyse af ELPMW kan opnås ved MALDI-TOF-MS, som også kan give yderligere oplysninger om renheden af ELP produkt sammen med retvinklede analytiske teknikker såsom high-performance væskekromatografi (HPLC).
Efter oprensning er ELP T t målt ved temperaturprogrammeret turbidimetri. Denne teknik overvåger OD af en ELP opløsning, mens temperaturen øges. T t er koncentrationsafhængig, så det er tilrådeligt at karakterisere en koncentration serie er relevant for den tilsigtede anvendelse af ELP. For ELP Homopolymerer turbiditeten profil udviser en enkelt, skarp stigning, der svarer til ELP overgangen fra Unimer til mikron-skala aggregater (figur 4A). T t er defineret som den temperatur, der svarer til vendepunktet i turbiditet profil bestemmes nøjagtigt som maksimum af den første afledede af OD med hensyn til temperatur. ReversibilitetELP faseovergang bekræftes ved et fald i OD til baseline som temperaturen sænkes under T t (figur 4B). Den uklarhed profil med stigende og faldende temperatur ramper vil variere i størrelse og kinetik grund til bilæggelse af ELP koacervater og variabel hysterese ELP resolubilization. Peptid-eller protein ELP fusioner ligeledes udviser LCST adfærd på denne måde, hvor peptidet eller proteinet er fusioneret til ELP påvirker T t. For protein ELP fusionerer overgangen er reversibel under smeltetemperaturen af proteinet. Mens temperaturprogrammeret turbidimetri er en fremragende metode til indledende termiske karakterisering af ELP produkter, alternative teknikker, såsom differentiel scanningskalorimetri (DSC), kan også anvendes til at måle ELP T t.
ELPS med mere komplekse arkitekturer udviser mere komplicerede termiske adfærd, der kan også være kendetegnet ved temperatur-prograMMED turbidimetri. ELP diblokcopolymerer, for eksempel, udviser en karakteristisk turbiditet profil, der svarer til deres temperatur-udløst selvsamling til sfæriske miceller på deres kritiske micellization temperatur. For sådanne ELP diblokcopolymerer OD typisk først stiger 0,1-0,5 enheder over baseline, der angiver overgangen fra unimers til miceller, hvorefter en kraftig stigning i OD (op til 2,0 enheder over baseline) ved en højere temperatur indikerer dannelsen af micron-skala aggregater (figur 5A). Yderligere information om temperatur-udløst selvsamlede ELP strukturer opnås med DLS, en teknik, der måler R H ELP samlinger i opløsning. Ændringer i R H enig tæt sammen med ændringer i OD målt med turbidimetri (figur 5B). ELP unimers typisk udviser en R H <10 nm, mens nanopartikel forsamlinger udviser en R H ~ 20-100 nm og aggregater udviser en R H </sub >> 500 nm. Yderligere information om selvsamlede ELP nanopartikler, såsom aggregeringsnummer og morfologi kan opnås ved statisk lysspredning eller kryogen transmissionselektronmikroskopi 17, 23, 29.
På grund af justerbarhed af ELP termiske egenskaber, er en vifte af T t s opnået ved forskellige ELP designs. Det er vigtigt at huske på, at den iboende T t vil påvirke optimering af oprensningsprotokollen for hver ELP, hvor ekstremt lav eller høj T t s vil kræve mest modifikation til denne standard protokol. ELPS med ekstremt høje temperaturer overgang kan være uegnet til rensning med denne fremgangsmåde. Hvis udformningen af nye ELPS og peptid eller protein ELP fusioner kan kompromittere den termiske reaktion ELP kan en simpel histidinmærke medtages alternative oprensning ved immobiliseret metal-affinitetskromatografi. Derudoveregenskaber ELP sekvens kan kræve ændring af denne protokol, hvis gæsten rest er opladet. Manipulation af pH kan anvendes som en metode til at ændre den samlede afgift af ELP i et forsøg på at eliminere elektrostatiske interaktioner med kontaminanter 17. Desuden er denne protokol er passende for den særlige omstændighed, af ELP fusioner med peptider og proteiner, når der træffes passende foranstaltninger for at sikre, rensningsprocessen ikke forstyrrer aktiviteten af den fusionerede delen. Noter hele protokollen om sådanne ændringer tjener til at lede rensning af ELPS, der kan præsentere disse udfordringer med hensyn til t t, opladning, eller fusion bekymringer.
Oprensningen af ELPS ved hjælp af deres LCST adfærd viser en enkel og kromatografi-fri fremgangsmåde til at oprense de fleste af ELPS og peptid-eller protein ELP fusioner udtrykkes i E. coli. Protokollen opsummeret her tillader rensning of ELPS i en enkelt dag ved hjælp af udstyr, der er fælles for de fleste biologiske laboratorier. Den lette rensning af ELPS og deres fusioner vil, håber vi, tilskynde til en stadigt voksende mangfoldighed i ELP designs til nye applikationer i materialevidenskab, bioteknologi og medicin.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NSF Research Triangle MRSEC (DMR-1.121.107).
pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels. |
Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |