Este artigo descreve um método para gerar embriões quiméricos que são projetados para testar as contribuições específicas de espécies de crista neural e / ou outros tecidos para o desenvolvimento craniofacial.
A geração de embriões quiméricos é uma abordagem ampla e poderosa para estudar os destinos celulares, interações tecido e espécie-específicos contribuições para a análise histológica e desenvolvimento morfológico dos embriões vertebrados. Em particular, a utilização de embriões quiméricos estabeleceu a importância da crista neural em dirigir a morfologia específica da espécie do complexo craniofacial. O método aqui descrito utiliza duas espécies de aves, pato e codorniz, com notavelmente diferente morfologia craniofacial. Este método facilita muito a investigação da regulação molecular e celular de padrão específico da espécie no complexo craniofacial. Experimentos em codorna e pato embriões quiméricos já revelaram interações mediadas tecido da crista neural e comportamentos de células-autônoma que regulam padrão espécie-específicos no esqueleto craniofacial, musculatura e tegumento. A grande diversidade de derivados da crista neural sugere um potencial significativopara futuras aplicações do sistema quimérico codorna-pato para a compreensão do desenvolvimento dos vertebrados, doenças e evolução.
O esqueleto facial desenvolve com o crescimento e fusão de vários processos faciais que são compostos de crista neural e mesodermal mesenchyme cercado por ectodérmica e camadas epiteliais endoderme 1-11. Eventos morfogenéticos dentro de cada processo são regidos por interações de sinalização distintas entre o mesênquima e epitélio em torno de 12-16. Alterações a estas interações de sinalização e / ou seus efetores downstream contribuir para fenótipos da doença e também pode ser relevante para a evolução do esqueleto craniofacial 17, 18. Portanto, elucidando o momento ea natureza das interações de tecido tem um grande potencial para aumentar a nossa compreensão da biologia do desenvolvimento e da evolução do esqueleto facial.
A utilização de embriões quiméricos para investigar as interações de tecido tem uma longa história em biologia do desenvolvimento. Esta abordagem foi iniciada por Hans Spemann e seu laboratórioque descobriu embrionárias "organizadores" através do transplante de tecidos entre os embriões de diferentes espécies de anfíbios. Spemann era um mestre de técnicas de micro-cirúrgicos, cuja mão-habilidades foram complementadas com o seu desenvolvimento de ferramentas especializadas, nomeadamente a pipeta Spemann. Viktor Hamburger era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hans Spemann em Freiburg durante a década de 1920, que é quando os experimentos de transplante de originais que levaram ao Prêmio Nobel da Spemann foram realizados. Quando Hamburger mudou-se para Washington University, em St. Louis, em 1935, ele detalhou o processo de fazer uma micropipeta Spemann em seu Manual de Embriologia Experimental 19. Desenhou Noden era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hamburger na Universidade de Washington até 1972. Depois de se mudar para a Universidade de Massachusetts, Amherst e depois para a Universidade de Cornell, Noden continuou fabricando e usando micropipetas Spemann por seus transplantes cirúrgicos envolvendo quimeras codorna-galinha. &# 160;. Enquanto um estudante de pós-graduação, um dos autores (Rich Schneider) treinados, com Drew Noden em Cornell 1995-1998 O protocolo a seguir para fazer uma micropipeta Spemann é baseado em descrições escritas por Hamburger e Noden e inclui modificações subseqüentes feitas por Schneider.
O uso de quimeras codorna-de bico para o estudo do desenvolvimento craniofacial e, especialmente, para a compreensão das contribuições de células da crista neural foi iniciada por Noden e por Le Douarin no início de 1970, revisto em Le Douarin et al 20. Esta abordagem tem sido amplamente adotado em muitos estudos e por inúmeros outros pesquisadores 1, 4, 5, 21-38. As taxas equivalentes de crescimento e morfologia de codorna e galinha fazer transplantes dentro deles ideal para o estudo do destino celular e rastreamento de linhagem. No entanto, por causa das semelhanças entre codorna e galinha, alterações morfológicas induced por células do doador são difíceis de decifrar. Em contraste, outros sistemas quiméricos aviária incluíram pato doméstico como uma forma de estudar os mecanismos que fazem embriões anatomicamente distinto 39-50. Mais especificamente, o sistema quimérico codorna-pato oferece vários benefícios para discernir os efeitos do doador sobre o hospedeiro, e vice-versa. Primeiro, os embriões de codorna e pato são distintas no tamanho do corpo e forma, que fornece uma maneira direta para explorar ou doador-mecanismos específicos do hospedeiro de formação de padrões através da análise para domínios diferenciais de expressão gênica (Figuras 1 A e B). Em segundo lugar, os embriões de codorna e pato têm consideravelmente diferentes taxas de maturação, com codorna incubação em 17 dias e pato eclosão em 28 dias. Crista neural transplantados mantém a sua taxa de maturação intrínseca dentro do ambiente de acolhimento e, assim, a identificação de mudanças temporais na expressão gênica, interações tecido, histogênese e morfogênese é possível51-57. Finalmente, o anticorpo anti-nuclear de codorniz (Q ¢ PN) permite que os dadores e albergar as contribuições celulares para ser permanentemente distinguidos um do outro através do reconhecimento de uma proteína que é expressa ubiquamente em células de codorniz, mas ausente de células de pato.
A crista neural é uma população de células embrionárias transiente que migra muito em todo o embrião e diferencia-se em diversos tipos celulares, incluindo osteoblastos, condrócitos e que contribuem para o esqueleto craniofacial. Transplante crista neural no sistema quimérico codorna-pato tem contribuído grandemente para a nossa compreensão das interações de tecido e vias de sinalização que regulam o desenvolvimento do esqueleto craniofacial. No entanto, dado o vasto potencial da crista neural também gerar células musculares lisas, adipócitos, melanócitos, células de Schwann, neurônios, o sistema quimera codorna-pato tem um tremendo potencial para futuras aplicações, particularmente em conjunto com o rápido avanço da biologia de células-tronco e medicina regenerativa. Desde codorna e pato são as duas espécies criadas comercialmente, um pronto fornecimento de ovos fertilizados relativamente barata está disponível a partir de uma variedade de fazendas. Assim, esta técnica deve ser acessível a researcdela operando dentro de uma ampla gama de orçamentos e espaço facilidade.
Embora esta técnica é muito poderosa, ainda há várias limitações. Como outras técnicas cirúrgicas, a qualidade ea viabilidade de quimeras codorna-pato confiar nas habilidades cirúrgicas do pesquisador e, portanto, não haverá mais variação inter e intra-individual entre os experimentos, em comparação com outros modelos, como aqueles que utilizam o mouse genética. Além disso, há também a variação nas taxas de desenvolvimento e as fases de embriões individuais que contribuem para a reprodutibilidade e sucesso de cada transplante. Embriões de aves também são muito suscetíveis à desidratação e, portanto, as etapas críticas durante a cirurgia incluem manter os níveis de luz baixa, o tempo sob o microscópio a um mínimo, os ovos seladas com fita adesiva, tanto quanto possível, e alta umidade na incubadora de pós-operatório de evitar a dessecação.
Em termos de viabilidade das quimeras, usually entre 50-75% sobrevivem, embora estas percentagens podem diminuir o mais velho a etapa de coleta. Em uma típica sessão de 4-6 horas de cirurgia, um cirurgião experiente pode gerar 10-15 quimeras. O sucesso dos transplantes também depende muito da qualidade das ferramentas. Boas ferramentas de levar a resultados reprodutíveis, mais consistentes. Usando um maçarico para fazer agulhas de tungstênio permite agulhas extremamente afiadas para ser feita. O tipo de tocha usado faz uma grande diferença, pois controla o tamanho da chama. Nitidez eletrolítica também pode ser usado, mas esta abordagem não chega nem perto de produzir agulhas tão acentuada. Utilize hastes de tungstênio em vez de fios acondicionados em bobinas de modo que as agulhas podem ser feitas em linha reta.
A micropipeta de Spemann, enquanto que consome tempo e é difícil de fazer, é um instrumento ideal para a transferência do tecido. A pipeta pode ser personalizado com diferentes tamanhos de aberturas, e pode ser utilizado repetidamente. Um fator crítico para usinga Spemann micropipeta é ter algum líquido no pipeta antes de tocar a ponta para a superfície do embrião. Algum do fluido irá fluir sempre para fora quando o contacto é feito com o menisco sobre o embrião. Pressionando sobre o diafragma permite que o tecido fluido e enxerto a ser ejetado de forma muito precisa, ao passo que um pouco desistir no diafragma suavemente suga o tecido doador do enxerto para a pipeta. A manutenção de um pouco de pressão positiva no diafragma mantém o tecido do enxerto doador na ponta da pipeta durante a transferência, e um pouco de pressão adicional sobre o diafragma permite que o tecido do enxerto doador para ser deliberadamente colocado no hospedeiro.
Para a proteção da pipeta Spemann durante o armazenamento e esterilização, retire a lâmpada a partir do final de largura e insira cuidadosamente a ponta cônica para o bulbo. Coloque a pipeta Spemann em um tubo de ensaio de vidro, cubra a parte superior com uma folha de alumínio, e autoclave antes da cirurgia. Após várias pipetas são reAdy para ser esterilizado novamente para a cirurgia, inverter as pipetas, aquecê-los quase a ferver na mesma solução de água destilada e de detergente de vidro, e em seguida enxaguar repetidamente com água destilada. Pipetas Autoclave em seus tubos individuais. O tubo de borracha que se forma o diafragma eo bulbo de borracha deve ser substituído depois de várias esterilizações ou quando se tornam escurecido e duro.
Muitos dos componentes do presente protocolo envolve equipamento perigoso. Por exemplo, o procedimento para a realização de um Spemann Micropipeta envolve três tipos de chamas, bem como aquecimento, puxar, sopro, dobra, corte e polimento de vidro. Portanto, uso de equipamento de proteção individual adequado (PPE), que aumenta a segurança, como óculos de proteção e um jaleco é crítica. Além disso, porque muitas pessoas sofrem, ou têm potencial para se desenvolver, alergias ao ovo, use sempre luvas ao manusear ovos. Com estas precauções em mente, o sistema quimérico codorna-pato isa método seguro, eficiente e relativamente acessível, que tem muitas aplicações futuras.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (NIDCR) concessão F32 (DE021929) para JLF e uma bolsa DE016402 NIDCR R01 para RAS
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |