Эта статья описывает способ генерировать химерных эмбрионов, которые предназначены для проверки по конкретным видам вкладов нервного гребня и / или других тканей к черепно-лицевого развития.
Поколение химерных эмбрионов является широко распространенной и мощный подход к изучению клеточных судьбы, ткани взаимодействия и видоспецифичные вклад в гистологических и морфологических развития эмбрионов позвоночных. В частности, использование химерных эмбрионов установил важность нервного гребня в направлении на конкретные виды морфологию черепно-лицевой комплекса. Метод, описанный здесь использует два вида птиц, утки и перепела, с удивительно разной черепно-лицевой морфологии. Этот метод значительно облегчает исследование молекулярной и клеточной регуляции видоспецифичного рисунком в черепно-лицевой комплекса. Эксперименты в перепелиных и утиных химерных эмбрионов уже показал нервного гребня опосредованного тканей взаимодействия и клеточно-автономным поведения, которые регулируют видоспецифических шаблон в черепно-лицевой скелет, мускулатуру и кожного покрова. Большое разнообразие нейронных производных гребня предполагает значительный потенциалдля будущих применений перепела-утки химерных системы к пониманию развития позвоночных, болезни и эволюцию.
Скелет лица развивается из роста и слияния нескольких процессов лица, которые состоят из нервного гребня и мезодермального мезенхимы окружении эктодермального и энтодермальных эпителиальных слоях 1-11. Морфогенетические события, произошедшие в каждом процессе, регулируются различными взаимодействиями сигнализации между мезенхимы и прилегающих эпителия 12-16. Изменения в этих сигнальных взаимодействий и / или их нижестоящих эффекторов способствовать фенотипов заболевания, а также могут иметь отношение к эволюции черепно-лицевой скелет 17, 18. Поэтому выяснение сроков и характера ткани взаимодействий имеет большой потенциал для увеличения нашего понимания развития и эволюционной биологии лицевого скелета.
Использование химерных эмбрионов для исследования тканей взаимодействия имеет долгую историю в биологии развития. Этот подход был впервые Гансом Spemann и его лабораториикоторый обнаружил эмбриональных "организаторы" путем пересадки тканей между эмбрионов разных видов амфибий. Спеманн был мастером микро-хирургических методов, чьи руки навыков были дополнены его развития специализированных инструментов, в частности, пипетки Спеманн. Виктор Гамбургер был аспирантом в лаборатории Ганса Spemann во Фрайбурге в 1920, который является, когда были выполнены оригинальные эксперименты по пересадке, которые привели к Нобелевской премии Шпемана. Когда Гамбургер переехал в Университете Вашингтона в Сент-Луисе в 1935 году, он подробно процесс создания микропипетки Спеманн в его Руководстве по экспериментальной эмбриологии 19. Дрю Noden не был аспирантом в лаборатории Гамбургера Вашингтонского университета до 1972 года. После переезда в Университете Массачусетса, Амхерст, а затем в университете Корнелла, Noden продолжал изготовления и использования Спеманн микропипетки за его хирургические трансплантации, связанных с перепелиным-куриных химер. &# 160;. Несмотря на то, аспирант, один из авторов (Rich Schneider) подготовленных с Дрю Noden в Корнельском с 1995 по 1998 Следующий протокол для принятия микропипетки Спеманн основана на описаниях, написанных Гамбургер и Noden, и включает в себя последующие изменения, внесенные Шнайдер.
Использование перепела-куриных химер для изучения черепно-лицевого развития и особенно для понимания вклада клеток нервного гребня был впервые Noden и Ле Douarin в начале 1970-х, отзывы в Ле Douarin др. 20. Этот подход был широко принята во многих исследованиях и многочисленными другими исследователями 1, 4, 5, 21-38. Эквивалентные темпы роста и морфологии перепелов и кур сделать пересадки в них идеально подходит для изучения клеточных судеб и рода трассировки. Тем не менее, из-за сходства между перепелов и кур, морфологические изменения индuced по донорских клеток трудно расшифровать. Напротив, другие птиц химерные системы включили домашней утки, как способ изучения механизмов, которые делают эмбрионы анатомически отличается 39-50. В частности, перепела-утка химерные система предлагает множество преимуществ для взыскательных эффекты донора на хосте, и наоборот. Во-первых, перепелиные и утиные эмбрионы отличаются по размеру тела и формы, что обеспечивает прямой путь для изучения-доноры или размещения с механизмы формирования структур путем анализа для дифференциальных доменов экспрессии генов (рис. 1 А и В). Во-вторых, перепелиные и утиные эмбрионы имеют значительно различные скорости созревания, с перепелиное инкубационное в 17 дней и утка штриховкой на 28 дней. Пересаживают нервного гребня сохраняет свою внутреннюю скорость созревания в принимающей среде, и, таким образом, идентификация временных изменений в экспрессии генов, ткани взаимодействий, гистогенеза и морфогенеза можно51-57. Наконец, анти-перепела ядерное антитело (Q ¢ PN) позволяет доноров и принимающих сотовые взносы, чтобы быть постоянно отличаются друг от друга, признав белок, который экспрессируется повсеместно в перепелиных клетках, но отсутствует от утиных клеток.
Нервного гребня является переходным эмбриональных клеточная популяция, что мигрирует широко по всему эмбриону и дифференцируется в разных типах клеток, включая хондроциты и остеобласты, которые вносят вклад в черепно-лицевой скелет. Пересадка нервного гребня в перепела-утки химерных системы внесла большой вклад в наше понимание тканей взаимодействий и передачи сигналов, регулирующих развитие черепно-лицевой скелет. Однако, учитывая огромный потенциал нервного гребня также генерировать гладкомышечных клеток, адипоциты, меланоциты, Шванн клетки и нейроны, система химера перепела-утка имеет огромный потенциал для будущих приложений, особенно в сочетании с быстрым развитием биологии стволовых клеток и регенеративная медицина. Поскольку перепела и утки являются коммерчески разводят видов, готовая поставка относительно недорогих оплодотворенных яиц доступна из различных хозяйств. Таким образом, этот метод должен быть доступен для Researcее эксплуатации в широком диапазоне бюджетов и объекта пространстве.
Хотя этот метод является очень мощным, остаются некоторые ограничения. Как и другие хирургические методы, качество и жизнеспособность перепела-утки химер полагаться на хирургических навыков исследователя, и поэтому, будет больше меж-и внутри-индивидуальные различия между экспериментами по сравнению с другими моделями, такими как те, с использованием мыши генетика. Кроме того, есть также различия в темпах развития и этапы отдельных эмбрионов, которые способствует воспроизводимости и успеха каждого трансплантата. Эмбрионов птиц также очень чувствительны к обезвоживанию и, следовательно, критические шаги во время операции включают сохраняя уровень освещенности низкий, время под микроскопом до минимума, яйца запечатанные с лентой как можно больше, и высокая влажность в послеоперационном инкубатора в избежать высыхания.
С точки зрения жизнеспособности химер, Uвенно между 50-75% выжить, хотя эти проценты могут снизить старше этапе сбора. В типичной 4-6 ч сессии хирургии, опытный хирург может генерировать 10-15 химеры. Успех трансплантации также в значительной степени зависит от качества инструментов. Хорошие инструменты привести к более последовательной, воспроизводимых результатов. Использование пропановой горелки, чтобы сделать вольфрама иглы позволяет чрезвычайно острые иглы должны быть сделаны. Тип фонарика используется делает большой разницы, потому что он контролирует размер пламени. Электролитические заточка также может быть использован, но этот подход даже не приблизились к производству игл столь резким. Используйте стержни вольфрама вместо буферного проволоки так, чтобы иглы может сделаться прямым.
Спеманн микропипетка, в то время как много времени и трудно сделать, является идеальным инструментом для передачи ткани. Пипетка могут быть настроены с различного размера отверстия, и может быть использован повторно. Критическим фактором для Усинга Спеманн микропипетка это иметь некоторый жидкость в пипетку до касания кончиком к поверхности эмбриона. Некоторые из жидкости всегда будет вытекать, когда происходит контакт с мениска над эмбриона. Нажатие на диафрагму позволяет жидкости и трансплантат ткани необходимо извлечь очень точно, в то время как немного ослабевания на диафрагму мягко сосет донорской трансплантата ткани в пипетку. Поддержание немного положительном давлении на мембрану удерживает донорской ткани трансплантата на кончике пипетки при передаче, и немного дополнительное давление на диафрагму позволяет донор трансплантата ткани быть преднамеренно помещен в хосте.
Для защиты пипетки Спеманн при хранении и стерилизации, снимите лампу от широкого конца и осторожно вставьте конический наконечник в луковице. Поместите пипетку Спеманн в стеклянную пробирку, прикасайтесь к верхней алюминиевой фольгой, и автоклав до операции. После нескольких пипетки повторноADY, подлежащие стерилизации снова к операции, инвертировать пипетки, нагреть их почти до кипения в том же растворе дистиллированной воды и посуды моющим средством, а затем промойте несколько раз дистиллированной водой. Автоклав пипетки в их отдельных труб. Резиновые трубки, которая образует диафрагму и резиновую грушу следует заменить после нескольких стерилизации или когда они становятся потемнела и жесткой.
Многие из компонентов этого протокола привлекать опасное оборудование. Например, порядок принятия Спеманн Микропипетки включает три типа пламени, а также отопление, потянув, дует, гибки и резки, и полировки стекла. Поэтому носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), что повышает безопасность таких как очки и лабораторный халат имеет решающее значение. Кроме того, поскольку многие люди страдают от, или имеют потенциал для развития, аллергии яйцо, всегда использовать перчатки при работе с яйца. С помощью этих мер предосторожности в виду, перепел-утка химерные система яса безопасной, эффективной и относительно доступный метод, который имеет много будущих приложений.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась по Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) F32 грант (DE021929) к JLF и безвозмездной NIDCR R01 DE016402 к РАН
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |