Dit artikel beschrijft een werkwijze voor chimeer embryo's die zijn ontworpen om de soortspecifieke bijdragen van neurale en / of andere weefsels craniofaciale ontwikkeling testen genereren.
De generatie van chimere embryo's is een wijdverspreide en krachtige aanpak van celtypes, weefsel interacties en soortspecifieke bijdragen aan de histologische en morfologische ontwikkeling van gewervelde embryo's te bestuderen. Met name het gebruik van chimere embryo het belang van neurale vastgesteld richten van de species-specifieke morfologie van het craniofaciale complex. De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van twee vogelsoorten, eend en kwartel, met opmerkelijk verschillend craniofaciale morfologie. Deze methode aanzienlijk vergemakkelijkt het onderzoek van de moleculaire en cellulaire regulatie van soortspecifieke patroon in het craniofaciale complex. Experimenten in kwartel en eend chimere embryo's hebben al onthuld neurale-kuif gemedieerde weefsel interacties en cel-autonome gedrag dat soort-specifiek patroon in het craniofaciale skelet, spieren, en integument reguleren. De grote diversiteit van neurale derivaten suggereert aanzienlijk potentieelvoor toekomstige toepassingen van de kwartel eend chimere systeem begrijpen gewervelde ontwikkeling, ziekte en evolutie.
Het gezicht skelet ontwikkelt zich uit de groei en fusie van meerdere gezicht processen die zijn samengesteld uit de neurale lijst en mesodermal mesenchym omgeven door ectodermale en endodermale epitheellagen 1-11. Morfogenetische gebeurtenissen binnen elk proces worden beheerst door duidelijke signalering interacties tussen de mesenchym en de omliggende epitheel 12-16. Wijzigingen in deze signalering interacties en / of de stroomafwaartse effectoren bijdragen aan de ziekte fenotypes en kan ook de ontwikkeling van craniofaciale skelet 17, 18 relevant zijn. Daarom is het ophelderen van de timing en de aard van het weefsel interacties heeft een groot potentieel om ons begrip van de ontwikkelings-en evolutionaire biologie van het gezicht skelet verhogen.
Het gebruik van chimere embryo's om weefsel interacties te onderzoeken heeft een lange geschiedenis in de ontwikkelingsbiologie. Deze aanpak is ontwikkeld door Hans Spemann en zijn labdie embryonale "organisatoren" ontdekt door het transplanteren van weefsels tussen de embryo's van verschillende soorten amfibieën. Spemann was een meester van micro-chirurgische technieken wiens hand-vaardigheden werden aangevuld door zijn ontwikkeling van gespecialiseerde tools, met name de Spemann pipet. Viktor Hamburger was een afgestudeerde student in het laboratorium van Hans Spemann in Freiburg tijdens de jaren 1920, dat is wanneer de oorspronkelijke transplantatie experimenten die leidden tot Spemann de Nobelprijs werden uitgevoerd. Bij Hamburger verhuisde naar Washington University in St. Louis in 1935, gedetailleerd hij het proces van het maken van een Spemann micropipet in zijn Manual of Experimental Embryologie 19. Drew Noden was een afgestudeerde student in het lab Hamburger bij de Universiteit van Washington tot 1972. Na de verhuizing naar de Universiteit van Massachusetts, Amherst en daarna naar Cornell University, Noden voortgezet fabriceren en gebruiken Spemann micropipetten voor zijn chirurgische transplantaties met kwartel-chick hersenschimmen. &# 160;. Terwijl een afgestudeerde student, een van de auteurs (Rich Schneider) getraind met Drew Noden aan de Cornell 1995-1998 Het volgende protocol voor het maken van een Spemann micropipet is gebaseerd op beschrijvingen geschreven door Hamburger en Noden, en omvat de volgende wijzigingen door Schneider.
Het gebruik van kwartel-chick chimeren voor de studie van craniofaciale ontwikkeling en vooral voor het begrip van de bijdrage van neurale cellen is ontwikkeld door Noden en Le Douarin in de vroege jaren 1970, beoordeeld Le Douarin et al. 20. Deze benadering is algemeen in veel studies en talrijke andere onderzoekers 1, 4, 5, 21-38 aangenomen. Het equivalent groeicijfers en de morfologie van kwartel en kuiken maken transplantaties binnen ze ideaal voor de studie van cel lot en lineage tracing. Echter, vanwege de overeenkomsten tussen kwartel en kuiken, morfologische veranderingen indhanteerden door donorcellen zijn moeilijk te ontcijferen. In tegenstelling, hebben andere aviaire chimere systemen binnenlandse eend opgenomen als een manier om de mechanismen die embryo anatomisch duidelijke 39-50 te bestuderen. Meer specifiek, de kwartel-eend chimere systeem biedt meerdere voordelen voor het onderscheiden van de effecten van de donor op de host, en vice versa. Eerste, kwartel en eend embryo's zijn te onderscheiden in het lichaam van grootte en vorm, die een directe manier om donor-of host-specifieke mechanismen van patroonvorming verkennen door te testen op differentiële domeinen van genexpressie (figuren 1 A en B) biedt. Tweede, kwartel en eend embryo's hebben aanzienlijk verschillende tarieven van rijping, met kwartel eitjes in 17 dagen en eend uitkomen in 28 dagen. Getransplanteerde neurale handhaaft haar intrinsieke rijping tarief binnen de nieuwe omgeving, en dus de identificatie van temporele veranderingen in genexpressie, weefsel interacties, histogenese en morfogenese is mogelijk51-57. Tenslotte, de anti-nucleaire antilichamen kwartel (Q ¢ PN) maakt donor en gastheer cellulaire bijdragen permanent onderscheiden van elkaar door het herkennen van een eiwit dat alomtegenwoordig tot expressie wordt gebracht in kwartel cellen maar afwezig eend cellen.
De neurale een voorbijgaande embryonale celpopulatie die uitgebreid migreert hele embryo en differentieert in diverse celtypen, waaronder chondrocyten en osteoblasten, die bijdragen aan het craniofaciale skelet. Het transplanteren van de neurale lijst in de kwartel-eend chimere systeem heeft veel bijgedragen aan ons begrip van het weefsel interacties en signaalwegen in de ontwikkeling van het craniofaciale skelet reguleren. Echter, gezien de enorme mogelijkheden van neurale lijst te genereren ook gladde spiercellen, adipocyten, melanocyten, Schwann-cellen en neuronen, de kwartel-eend chimera systeem heeft een enorm potentieel voor toekomstige toepassingen, met name in combinatie met de snelle vooruitgang van de biologie van de stamcel en regeneratieve geneeskunde. Sinds kwartel en eend zijn zowel commercieel gekweekt soorten, een klaar levering van relatief goedkope bevruchte eieren is beschikbaar uit een verscheidenheid van bedrijven. Daarom moet deze techniek toegankelijk zijn researchare die binnen een breed scala van budgetten en facilitaire ruimte.
Hoewel deze techniek zeer krachtig, blijven er verscheidene beperkingen. Net als andere chirurgische technieken, de kwaliteit en de houdbaarheid van kwartel eend chimeren vertrouwen op de chirurgische vaardigheden van de onderzoeker, en daarom zal er meer inter-en intra-individuele variatie tussen experimenten in vergelijking met andere modellen, zoals gebruik muis te genetica. Bovendien is er ook variatie in het ontwikkelingstempo en stadia van individuele embryo dat tot de reproduceerbaarheid en het succes van elk transplantaat. Vogelembryo's zijn ook zeer gevoelig voor uitdroging en dus kritische stappen tijdens chirurgie inhouden dat de lage lichtniveaus, de tijd onder de microscoop minste de gesloten met plakband zoveel mogelijk eieren en hoge vochtigheid in de postoperatieve incubator voorkomen uitdroging.
In termen van de levensvatbaarheid van de hersenschimmen, usually tussen 50-75% overleven, hoewel deze percentages de oudere kan verminderen de collectie podium. In een typische 4-6 uur zitting van de operatie, kan een ervaren chirurg 10-15 hersenschimmen genereren. Het succes van de transplantatie hangt ook sterk af van de kwaliteit van het gereedschap. Goed gereedschap leiden tot een meer consistente, reproduceerbare resultaten. Met behulp van een propaantoorts om wolfraam naalden maken laat zeer scherpe naalden worden gemaakt. Het type toorts maakt een groot verschil omdat het bepaalt de grootte van de vlam. Elektrolytisch slijpen kan ook worden gebruikt, maar deze aanpak niet eens in de buurt aan het produceren van naalden zo scherp. Gebruik wolfraam staven in plaats van wachtrij draad zodat de naalden direct kan worden gemaakt.
De Spemann micropipet, terwijl tijdrovend en moeilijk te maken, is een ideaal instrument voor weefsel-overdracht. De pipet kan worden aangepast met verschillende grootte openingen, en kan meerdere malen worden gebruikt. Een kritische factor voor usinga Spemann micropipet is om wat vloeistof in de pipet voordat u met de punt naar het oppervlak van het embryo. Een deel van de vloeistof zal altijd vloeien wanneer contact wordt gemaakt met de meniscus over de embryo. Drukken op het membraan laat vloeistof en graft weefsel heel precies worden uitgeworpen, terwijl iets te laten op het membraan voorzichtig zuigt de donor transplantaat weefsel in de pipet. Handhaving wat positieve druk op het membraan blijft de donor transplantaat weefsel aan het uiteinde van pipet tijdens de overdracht, en een beetje extra druk op het membraan kan de donor transplantaat weefsel opzettelijk geplaatst in dezelfde gastheer.
Ter bescherming van de Spemann pipet tijdens opslag en sterilisatie, verwijder de lamp uit het brede uiteinde en plaats voorzichtig de taps toelopende tip in de lamp. Plaats de Spemann pipet in een glazen reageerbuis, bedek de bovenkant met aluminiumfolie, en autoclaaf voorafgaand aan de operatie. Na meerdere pipetten zijn ready opnieuw worden gesteriliseerd voor een operatie, keren de pipetten, verwarm ze bijna aan de kook in een zelfde oplossing van gedestilleerd water en glaswerk wasmiddel, en vervolgens herhaaldelijk spoelen met gedistilleerd water. Autoclaaf pipetten in hun individuele buizen. De rubberen slangen die het middenrif en de rubberen peertje vormt moet worden vervangen na een aantal sterilisaties of wanneer ze verduisterd en stijf.
Veel van de onderdelen van dit protocol te betrekken gevaarlijke apparatuur. Bijvoorbeeld, de procedure om een Spemann Micropipet omvat drie soorten vlammen en verwarming, trekken, blazen, buigen, snijden en polijsten glas. Daarom is het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), dat de veiligheid verhoogt, zoals een veiligheidsbril en een laboratoriumjas is van cruciaal belang. Bovendien, omdat veel mensen last van, of hebben het potentieel om te ontwikkelen, ei allergie, altijd handschoenen bij het hanteren van eieren. Met deze voorzorgsmaatregelen in het achterhoofd, de kwartel-eend chimere systeem isa veilig, efficiënt en relatief toegankelijke methode die veel toekomstige toepassingen heeft.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door een National Institute of Dental en Craniofacial Onderzoek (NIDCR) F32-subsidie (DE021929) naar JLF en een NIDCR R01 subsidie DE016402 RAS
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |