JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

Published: January 15, 2015
doi:
10.3791/51483
, , , , ,
1Department of Psychiatry,University of Pittsburgh Medical Center, 2Department of Bioengineering,Stanford University, 3Department of Brain and Cognitive Sciences, Picower Institute for Learning and Memory,Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurobiology and Behavior,Cornell University, 5Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,Stanford University

Summary

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Abstract

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Introduction

Оптогенетика революцию системы на уровне неврологии в поисках нейронных элементов цепи управления нормальные и болезнетворные соответствующие поведенческие состояния. Открытие того, что светочувствительные микробные опсины 1 может быть функционально экспрессируется в клетках млекопитающих при условии, что платформу для использования света для получения беспрецедентный контроль нейронной активности с высоким пространственным и временным точностью 2. В отличие от традиционных электрофизиологических или фармакологических подходов к манипуляции нейронной активности, Оптогенетика позволяет для контроля специфических типов клеток (на основе генетического идентификации или пространственной проекции) в гетерогенных популяций и в физиологически соответствующих сроков. Последующее введение нервного оптического интерфейса при условии, в практический инструмент для доставки света, чтобы вести животных 3. Это позволило в режиме реального времени модуляции, определенных нейронных цепей в активных ведет себя грызунов для того, чтобы причинно проверитьРоль этих нейронных цепей в управлении поведенческих состояний, связанных с неврологической и психиатрической болезни 4-6. Оптогенетика, следовательно, представляет собой мощный инструмент для введения в любой лаборатории, заинтересованной в расследовании функциональную зависимость между активностью мозга и поведенческих или физиологических мер в моделях на животных.

Удачный дизайн и завершении optogenetic эксперимента включает в себя различные этапы и аспекты (рисунок 1). Цель настоящего Протокола заключается в обеспечении лиц с инструментов и компонентов, наряду с теоретическими и практическими знаниями, необходимых для выполнения optogenetic стимуляции у бодрствующих ведет себя грызунов. В настоящее время существует два преобладающих диапазонах длин волн, используемых для активации микроорганизмов опсина каналы: в синем спектров (обычно 473 нм) и желто-зеленый-спектры (обычно 532 или 591 нм). Оба лазера и светоизлучающие диоды (СИД) могут быть использованы в качестве источников света для Ðeliver конкретных длин волн света, чтобы ткани головного мозга. Некогерентного света, излучаемого светодиодами, однако, делает эффективную передачу света трудно при соединении в небольших основных волокон, необходимых для в естественных условиях стимуляции грызунов. Принятие решения о соответствующей лазерной сборки является важным первым шагом, и будет зависеть от предполагаемого использования Оптогенетика в лаборатории. Текущий протокол описывает два основных конфигураций, которые отличаются по легкости их монтажа и эксплуатации: одноместные предварительно связанных лазеров и двойной Лазерные системы (рис 2). Холост лазерные системы, которые предварительно сочетании заводом-изготовителем, в основном готов к использованию по прибытии с практически нет настройки требуется, но имеют недостаток минимальной настройки конечного пользователя. Двойной лазерной системой обеспечивает предоставление двух различных длинах волн вниз по одному волокну. Это становится все более важным с появлением комбинаторной Оптогенетика которых различные длины волн могут быть использованы для включения / ингибируют distincтипы Т-клеток, которые пространственно колокализуются. Это также важно для использования с би-стабильных ступенчатая функция опсинов где фототоки начала и конца синим и желтым светом, соответственно 7,8. Двойные лазерные системы также настраиваемый как пользователь может добавить или удалить компоненты (например, внешние жалюзи, фильтры балками, встроенное питание метров) от пути луча, как требуется. Благодаря своей универсальности, двойной лазерный настройки рекомендуется использовать, если Оптогенетика будет по-прежнему инструмент, используемый в лаборатории. Сцепление лазеров, однако, может представлять проблему и так быстро, просто и надежный механизм сцепления обеспечивается в этом протоколе. Обратите внимание, что этот протокол Подробнее сборку оптических компонентов и использует шнуры и компоненты, оптимизированные для ступенчатым профилем показателя преломления многомодового волокна с сердцевиной 200 мкм и числовой апертурой (NA) 0,22. Различные размеры ядра и NA доступны для покупки, однако все компоненты должны идеально совпадать с точки зрения ядраразмер и NA, чтобы избежать потери света в точках подключения волоконно. Кроме того, в связи волокон свет может проходить от меньшего к большему размеру основного; и / или от нижней-NA на более высокий-на волокна без дополнительной потери.

Стратегии Tethering предоставляются, которые позволяют одновременной стимуляции нескольких мышей для высокой пропускной тестирования поведения. Протоколы, предоставляемые предполагают использование хронических имплантируемых волокон для поведенческого тестирования, но может быть изменен при острых протоколов стимуляции. Остро имплантированные волокна являются предпочтительными для объединения optogenetic стимуляции фармакологической манипуляции, так как же канюли может использоваться для доставки лекарств и кончик оптического волокна в том же месте. Использование хронически имплантированных волокон, тем не менее, настоятельно рекомендуется для нескольких дней тестирования поведения, как это уменьшает повреждение ткани, связанного с повторным вставки и удаления волокон и увеличивает точность в плане последовательной размещения волокна дляткань освещенность 3. В сочетании с конфигурациями привязывать описанных здесь, поведение может быть записана на нескольких надежно дней. В самом деле, было сообщено надежный светопропускание месяцев после волокна имплантации 9 таким образом, что хроническая стимуляция и поведенческие парадигмы тестирования могут, теоретически, быть осуществлена ​​через несколько дней и недель. Дополнительные рекомендации по аппаратной части, которые были добавлены к протоколу, чтобы выбор читателя в лучший продукт, который будет отвечать их индивидуальным потребностям, в том числе экономически эффективных альтернатив и продуктов, которые могут быть сделаны в доме. Важные советы, которые являются полезными в процессе установки и внедрения также предоставляются.

Protocol

! ВНИМАНИЕ: Этот протокол предполагает использование лазерных устройств класса 3Б и требуют специальной подготовки и труда для подражания. Защитные очки следует носить в любое время при работе лазеров, с процедуры выравнивания представления особенно высокий риск. Свяжитесь с лазерной поставщика, чтобы определить очки, которые обеспечат максимальный ослабление для данного лазера. Если есть возможность, поступить в безопасности учебный курс институциональной лазера. Никогда не используйте лазер без соответствующего защитные очки и обучения. 1. Лазерное устройство Настройка В случае необходимости, шаги в разделе 1 обозначены как (А) или (В), чтобы различать один или два лазерных систем, соответственно. Прикрепите и закрепите лазеров плате. Макеты отличные проводники тепла и действовать в качестве теплоотвода, чтобы предотвратить повреждение внутренних лазерных компонентов при длительном использовании. () Закрепите предварительно сочетании ласьэ к 10 "х 12" макета (или по мере необходимости), используя ¼-20 "болты и шайбы (рис 2а). Если макеты отверстия не совпадают с лазерными монтажные отверстия, используйте маленькие "настольные зажимы», чтобы обеспечить лазер для макетов. (B) Если 2 лазеры, которые будут использоваться очень различные высоты луча (> ~ 1 см), использовать небольшие 4 "х 6" Макеты, чтобы создать платформу для одного из лазеров. Прикрепите эти доски с основными крупными 12 "X 18" макет, используя ¼-20 "болты с шайбами, затем прикрепите лазер для небольших плат с болты или табличных зажимы, как показано на рисунке 2В. Подключите другой лазер непосредственно к плате с помощью крепежных винтов или переменной зажим высота таблицы. Важнейший шаг: Макеты, винты и оптические компоненты могут быть приобретены как имперская или метрикой так тому и быть последовательным, покупки предметов; По умолчанию для этого протокола является имперским. (А)Приложите толщиной рубашкой с плоским скола / физический контакт (FC / PC) соединительного кабеля с муфтой (именуемой кабеля переходника, см рисунок 3), который физически подключен к передней части лазерного (рис 2а). (Б) Автор переходник на ¾ "оптической сообщению, а затем эпоксидные соединение между соединителем и в верхней части поста с помощью JB KWIK или аналогичный эпоксидную смолу, чтобы предотвратить смещение ослабления и во время использования. Прикрепите сообщение в плате (как макеты дыры не всегда совпадают с требуемой размещения оптических компонентов, держатель пост, основание штатива адаптера и зажима вилку используются для крепления оптического пост переходник в месте). Приложить толстым рубашкой соединительный шнур (переходник кабеля) к задней муфты. (В) Вставьте первый Поворотное зеркало для синего лазера в кинематической держателя, и прикрепить его к плате с помощью ¾ "оптический пост. Прикрепите эту должность базовой ADAPтер и зажим вилка. Установите прижимную вилку и после сборки непосредственно перед голубого лазера с зеркалом под углом 45 °, чтобы направить лазер в сторону дихроичным зеркалом. Используйте картину решетки отверстий на плате качестве приблизительного ориентира выравнивания. После грубой установки, используйте ¼ "-20 винт с головкой для крепления зажима вилку к плате (см рисунки 2B, C). (В) Вставьте дихроичную зеркало в кинематической держателя и прикрепить его к 1 "оптической должности и обеспечить непосредственно к плате. Установите дихроичного зеркала слева от, и в соответствии с того, что синий лазер зеркало. Угол дихроичное зеркало под углом 45 °, что синий свет, отраженный от первого зеркала, отражается в муфту, затем затяните винт крепления кинематической держатель на должность (см рисунки 2B, C). (B) Прикрепите первый Поворотное зеркало для желтого лазера до ¾ "оптического должности. Прикрепите Optiкал сообщение в базовой адаптера и зажима вилкой. Установите прижимную вилку и пост-ансамбль непосредственно перед желтой лазера и угла зеркала под углом 45 °, что желтый свет будет направлен в сторону второго рулевого зеркало. Закрепите прижимную вилку в месте с ¼ "-20 болта и шайбы. (B) Прикрепите вторую Поворотное зеркало для желтого лазера на 1 "оптической должности. Угол зеркала таким образом, что желтый луч света от первого зеркала будут отражены с помощью дихроичного и в соединитель (фиг.2с). Безопасный пост непосредственно к плате и затяните крепежные винты раз зеркало под углом соответствующим образом. Точная регулировка зеркал будет выполнено с использованием кинематических зеркало монтирует на более позднем этапе. (B) Прикрепите нейтральный фильтр плотности колесо ¾ "оптического должности и разместить пост в держатель после прикрепленной к монтажным основанием. Закрепите ансамбль плате между первым и себеCond желтые зеркала с помощью одного ¼ "-20 винт с головкой. Это колесо используется для регулировки мощности лазерного желтого света, достигающего переходник. Совет: Индивидуально затягивать все компоненты (такие как винты, крепящие кинематических Зеркало владельцев к началу должностей и нитей, имеющих базовые адаптеры для нижней части сообщения) перед установкой их на базу. Используйте вал небольшой шестигранный ключ в предоставляемой через отверстия в оптических сообщений, чтобы получить достаточный крутящий момент. Это позволит предотвратить компоненты выпадения во время использования, что требует перестройки. Прикрепите FC / PC к FC / PC адаптером L-кронштейна к плате. Дополнительно: Безопасный 1 х 2 50/50 мини-разветвитель куб волокна непосредственно к плате для одновременной стимуляции в естественных условиях двух или более животных. Кроме того, ручки могут быть добавлены, чтобы помочь в движении макета сборки (как показано на фиг.2А). 2. Лазерная Сцепление (Бесконтактная Стиль Сцепление) В этом разделе относится к двойной лазерной настройке (рис 2б). Совместите внутреннюю синий лазер путь до приведения внешнего желтый лазерный путь. ! ВНИМАНИЕ: Используйте при низкой освещенности связь питания (~ 1 мВт), чтобы обеспечить безопасность для глаз. Носите защитные очки для включения лазера и до интенсивность света измеряется и считаются безопасными. Установите переключатели на задней стороне лазера "Curr" (ток) и транзисторно-транзисторной логики режим (TTL) + при постоянном освещении (в отличие от аналогового режима). Убедитесь, что ручка питания на передней панели водителя устанавливается на ноль. Включите лазера путем включения драйвера, а затем клавишу лазера. Медленно отрегулировать ручку питания, расположенный на передней части лазерного водителя так, чтобы ~ 1 мВт лазерного света, излучаемого в настоящее время. Подождите 10 – 15 мин (или как указано производителем) для лазерной, чтобы согреться. Подключите кабельный тестер волоконно-оптический непосредственно к этой ООПе конец соединителя патч-корд и включите кабельного тестера (Рисунок 3А). Регулировка угла муфты таким образом, что красный луч проходит прямо назад по направлению к центру дихроичного зеркала. Путь пучок красного света, излучаемого из кабельного тестера точный путь, что входящий лазерный луч необходимо следовать, чтобы быть соединен в лазер. Выполните грубую выравнивание: Используйте боковые и горизонтальные выступы на кинематических зеркал, чтобы направить луч лазерного света в муфту. Постамент зажимы, возможно, потребуется ослабить немного изменить положение зеркала и переходник. Кинематические крепления все равно должны иметь некоторые туристические доступны для дальнейшей точной настройки. Не беспокойтесь, если не синий свет не испускается из сцепки подключением патч-корд в это время. Поместите один кусок полупрозрачного бумаги непосредственно перед дихроичным зеркалом, между дихроичным и муфты. Там будет и синий и арред точка на этой бумаге с лазером и кабельный тестер, соответственно. Использование бумаги, что является прозрачным достаточно, чтобы видеть, как красный и синий пятна одновременно с одной и той же стороне бумаги. Сделать точную настройку первой управляющей зеркала (т.е. один ближе к лазеру, а не дихроичным), тщательно регулируя боковые и горизонтальные ручки, чтобы выровнять положение центра красной точки с синей точкой. Перемещение бумаги обратно к св зи с тем, что она непосредственно перед муфтой и регулировки ручки на второй (т.е. дихроичный) зеркало для выравнивания лазерного луча с красного луча. Пройти по ступеням 2,6 & 2,7 до центра голубых / желтых и красных лучей не точно выровнены в обоих положениях (т.е. пока красный и синий лучи не лежат на одной прямой). Снимите кабельный тестер от кабеля переходника. Лазерный свет должен теперь быть, испускаемый из конца соединитель соединительного шнура. УстановNE эффективность связывания путем измерения силы света, испускаемого из кончика волокна сцепки соединительного шнура с помощью измерителя мощности. Используйте параметр 500 МВт на фотодиод измеритель мощности и изменить настройки длины волны (λ) на синий (473 нм) или желтый (635 нм) спектра света в зависимости от лазера используется. Поместите кончик волокна перпендикулярно фотодиода, чтобы получить показание мощности. Сравнение мощности света, поступающего в сумматор на мощности света, излучаемого от конца волокна. Эффективность связывания> 80% считается очень хорошим. Очень маленькие последующие корректировки второй рулевого зеркало может иногда немного улучшить сцепление. В общем, когда диаграмма направленности от конца соединительной волокна небольшой, плотно, центральное пятно (без колец, окружающих его), муфта эффективность в сердцевине волокна оптимальна. Повторите шаги 2,1 – 2,11 для желтого лазера связи, за исключением использования двух рулевых зеркала для желтого лазера (рис 2С). У нет регулировки положения зеркала дихроичным или выравнивания голубого лазера будут потеряны. 3. В естественных условиях Optogenetic Стимуляция Убедитесь, что все процедуры, связанные с использование животных проводятся в соответствии с местными и национальными руководящими принципами и утверждаются соответствующим Уходу за животными и использованию комитета. Оптическое волокно настройки (рис 3B для идентификации различных типов соединительных шнуров говорится ниже). Чтобы стимулировать одну мышь, соединить соединитель патч-корд к толстым рубашкой патч-корд с помощью FC / FC L-образный кронштейн адаптера, непосредственно присоединенный к плате (рис 4а). Чтобы стимулировать двух животных одного лазера, подключите переходник патч-корд к двум толстым рубашкой патч-кордов с использованием 1 х 2 50/50 мини куб (рис 4б). Чтобы стимулировать три или больше животных, прикрепите переходник питания к разветвитель на основе многомодового волокна с использованием 1 х 2 мINI куб уже подключен к плате (рис 4в). Прикрепите коммутатор / поворотный шарнир на свободных концах толстой оболочке сплиттер патч-корд / волокна. Коммутаторы имеют важное значение, поскольку они позволяют вращение волокна с движением грызуна, который предотвращает накопление крутящего момента на патч-корд. Слишком много крутящего момента может крутить шнуры, привести к поломке, и вмешиваться в естественное движение животного во время тестирования. Прикрепите животных патч-корд к коммутатору. Прикрепите соединительный сплит рукав к свободному концу металл наконечником животного патч-корд (рисунок 5). Не заставляйте рукав все, вплоть наконечника; оставить ~ 0,5 см рукав разоблачен как это то, что соединяет в имплантированного волоконно-оптических, прикрепленной к животным (Рисунок 6). Важнейший шаг: Всегда покупки рукава, которые содержат раскол, чтобы обеспечить расширение рукава над имплантированным волокна наконечника во время подключения иудаление. Слишком туго из порыве может вызвать серьезную травму животному, если имплантат смещает из черепа при попытке отсоединить шланг от имплантата. Если это имеет место, животное должно быть удалено из исследования и получать непосредственный уход ветеринара. Кроме того, перед использованием новой втулки в первый раз, "разбить его на 'с подключением и отключением наконечника, пока он не отсоединяет с желаемым количеством силы. Подсказка: Это легко сломать волокна при удалении рукав, который плотно прикрепленный к наконечником. Чтобы избежать этого, нажмите на наконечник путем вставки небольшой деревянный стержень в открытый конец втулки (ручка стандартной ватным тампоном нужного размера). Подключите синий лазерный драйвер с генератором импульсов с помощью кабеля BNC и включите генератор импульсов на. Положите соответствующие защитные очки на. Установите переключатели на задней стороне лазера и режим "Curr" "TTL +". Убедитесь, что ТНАт ручку питания на передней панели водителя устанавливается на ноль andturn лазер на (поверните драйвер на первый, а затем клавишу лазера). Регулировка ручки питания на передней панели лазера так, что 5 – 10 мВт, излучаемых из животных патч наконечником кабель волокна, как измерено с помощью измерителя мощности света. 5 – 10 мВт является общим руководством – точное энергоемкость должны влиять на данный объем ткани должны быть рассчитаны до начала эксперимента, как и в Aravanis др 3. Включите синий лазер в режим "Analog" для стимуляции в естественных условиях. Примечание: Желтые DPSS лазеры работают в TTL + режим для постоянного освещения. Подождите 10-15 минут для лазерной, чтобы согреться. Аккуратно сдерживать мыши и подключите сплит-втулку на животных патч-корд к хронической имплантируемого волокна (рис 6). Убедитесь, что концы обоих волокон делают физический контакт друг с другом. Используйте раскол на соединительном рукаве, какОкно для визуализации прямой контакт между двумя важный шаг:. Иногда мусор может собираться на металлической обоймы имплантируемого волокна животного и мешать нормальной связи. В этом случае используйте этанол протрите аккуратно очистите наконечник на голове животного до присоединения. Никогда не используйте силу, соединяющую втулку на наконечник, так как это может привести к серьезную травму животному. Если физическое соединение между концами волокон не могут быть сделаны после очистки, удаления животного из исследования. Совет: Свет может произойти утечка в месте соединения между имплантированного волокна и животного патч-корд. Визуализация этом свете грызунов может представлять экспериментальную посрамить 10. Термоусадочная трубка может быть присоединена к патч-кордов и скользнул по точке соединения, чтобы минимизировать посторонний свет. Разрешить мыши для восстановления в течение нескольких минут до начала поведенческого испытания. Совет: Depending на тесте поведенческой для введения, лучше всего, чтобы приучить мышей в процессе соединения и ограничивающей 2 – 3 дней до, как обработка требуется для подключения животное может вызвать стресс и смешивать поведенческим тестированием. Наведите в поведенческой тестирования аппарата, обеспечивающего, что разъем шнура бесплатно коряг. Никогда не оставляйте животное без присмотра во время стимуляции. Даже при использовании коммутаторов, коммутационные шнуры же имеют тенденцию к скручиванию в течение длительных периодов времени, что может помешать поведенческим тестированием. Использование генератора импульса к импульсу в голубой лазер на заранее определенной частоте, который будет активировать опсина выбора. Для желтого использования лазера: импульсный желтый лазер с внешним жалюзи или просто блокируя путь луча с непрозрачной, не отражающей, негорючий объекта. 4. Подать в естественных условиях стимуляции Соображения Этот раздел не предназначен для полной протокол, но предлагается в качестве руководства для дополнительных процедур, которые должны быть рассмотрены следующие в естественных условиях optogenetic стимуляции. После завершения эксперимента, подтверждают вирусную и волокна гистологически размещения для точной интерпретации поведенческих результатов. Эвтаназии животное в соответствии с институциональных принципов и заливать животное с ледяной фосфатно-солевом буфере (PBS) и 4% (вес / объем) параформальдегида в PBS. Удалить имплантированного волоконно-оптические, крепко держа открытой металлической наконечник с помощью плоскогубцев или кровоостанавливающих. Поднимите одним плавным, но быстрым, движения. Важно, чтобы проверить целостность имплантированной волокна путем измерения светового потока в конце каждого эксперимента. После исправить мозги в параформальдегиде в течение по крайней мере 24 – 48 часов до секционирования через область интересов. (При использовании микротом замерзания, инкубировать мозги в 30% растворе сахарозы в течение нескольких дней, прежде чем секционирования). Выполните иммуногистохимии с использованием STANDAй протоколы для выявления соответствующих Opsin с метками флуорофорами, то есть, зеленый флуоресцентный белок (GFP), повышение желтый флуоресцентный белок (EYFP) или mCherry. Проверить сайт экспрессии опсина и волокна имплантата под микроскопом и визуально подтвердить, соответствующий размещение вируса инъекции и имплантата на основе выбранных координат.

Representative Results

Поведенческие результаты, полученные с в естественных условиях optogenetic стимуляции полностью зависят от нервной цепи мишенью, модель на животных, и параметры модуляции. Для существующих указательных целей, допамин нейронов в вентральной области покрышки, или ВТА, тирозингидроксилазы :: мышей Cre были трансдуцированных с устойчивым ступенчатой ​​функции опсина (SSFO) 8, или контрольным вирусом (EYFP), и волокна имплантата хронически имплантации. Использование TH :: Cre трансгенных мышей гарантирует, что опсин выражение ограничено Th + клеток (дофамина) в ВТА. Рисунок 7 изображает представительства поведенческие результаты, полученные с использованием текущей описанной лазерной установки для одновременной стимуляции нескольких мышей. Здесь мышей и стимулировали привязи и в то же время, используя отдельные лазеры (3 мышей / лазера, как на фиг.4С) и поведение опорно-двигательного аппарата был записан в течение 1 часа. Повторное возбуждение дофаминовых нейронов в VTA в результатегиперактивный фенотип, что сохраняется на протяжении стимуляции. Никаких изменений в поведении опорно-двигательного аппарата не был замечен в EYFP мышей (смотрите видео 1). После тестирования поведения, иммуногистохимия было проведено с целью проверить точность вирусной ориентации на ВТУ дофамина нейронами и размещения волоконно визуально подтверждение (рисунок 7). Рисунок 1. Экспериментальные шаги для в естественных условиях optogenetic стимуляции. Там четыре основные шаги, связанные при проектировании и выполнении в естественных условиях optogenetic стимуляции. Этот протокол специально подробно этапы доставки света от лазерного источника света к глубинным структурам головного мозга в себя ведущему грызунов и включает в себя 1) в сборе лазерной системы и легкую связь; 2) стратегии Tethering для Connecting несколько животных к источнику света за большой пропускной тестирования поведения и 3) обеспечивает руководящие принципы для подтверждения адресности стратегию света поставки – шаг, который имеет важное значение для интерпретации данных. Примечание: хотя этот протокол не только для хронических имплантируемых волокон для целей привязывать, рекомендуется и считается при объединении optogenetic стимуляции с поведенческой тестирования. См как Унг & Arenkiel, 2012 18 и Спарта и др., 2012 9 для собственного производства и внедрения хронических оптических волокон. Сплошные линии = шаги, рассматриваемые в данном протоколе. Рисунок 2. Лазерные системы, используемые для в естественных условиях optogenetic стимуляции. (A) Одноместный Лазерная система для стимуляции в естественных условиях. Этот лазер является рН ysically предварительно соединены производителя и не требует особой конечного пользователя настройки. (B) Двойная система лазер. Два лазера соединены в одном волокне за счет использования зеркал, которые действуют, чтобы управлять каждый путь луча в бесконтактной св зи стиле. Это самый универсальный настроены как оптические компоненты могут быть удалены или добавлены по мере необходимости, но представляет более сложной задачей с точки зрения эффективного лазерного муфты. (C) Схема двойного лазерного системы, показанной на (B) с указанием размещения лазеров и зеркал с соответствующим пути лазерного луча света (стрелки) изображен. Здесь дихроичных зеркал "D", используется для отклонения синие длины волн света при передаче желтые длин волн до сцепки "C" и в прилагаемой соединитель соединительного шнура. B = синий лазер; C = бесконтактный стиль муфта; D = дихроичное зеркало; FW = фильтр колеса; M = зеркала; Y = желтый лазер.получить = "_ бланк"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Нижняя Рисунок 3. () Кабельный тестер используется в протоколе нефизической связи:. Кабельный тестер подключен непосредственно к патч-корд. Вставьте изображает точку подключения тестера к кабелю (B) Патч-корды упоминаемый в протоколе от внешнего к внутреннему:.. Многомодового сплиттер волокна, черный рубашкой животных патч-корд с белым циркония сплит рукав крепится к плоским скола (FC) конец, толщиной рубашкой соединительный шнур (также упоминается как "сцепки мозга"). Толстые рубашкой патч-корды покрывают поливинилхлоридной (ПВХ) труб для дополнительной защиты. Для этих кабелей, отраслевые стандартные цветовые коды используются для различения между различными типами волокон, где оранжевый = многомодовым волоконно. Животное патч-корды являются тоньше рубашкой для обеспечения гибкости для движения животных в процессе тестирования поведения. Обратите внимание, что пыльники размещены на FC / PC заканчивается, когда кабели не используются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 4. Tethering стратегии в естественных условиях optogenetic стимуляции (А) одного животного, (б) два животных; . (С) три или четыре животных возможные конфигурации не ограничены тем, что показаны выше – несколько конфигураций возможно через уникальное сочетание адаптеров, волоконно разделителей и ветвящихся патч-кордов, которые коммерчески доступны или на заказ заказ. Примечание: патч-корды и волоконно-разветвители содержать FC / PC разъемы на обоих концах (только один конец изображен).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 5. Правильное и неправильное (красный крестик) Подключение патч-корд к имплантируемого волоконно-оптических помощью сплит-рукав. (Левая панель) циркония сплит-рукав используется для подключения патч-корда с металлическим наконечником имплантируемого волоконно-оптических (как показано здесь не зациклен на животное). Стрелка показывает на точку соединения между патч-корд и имплантируемых волоконно-оптических. По сравнению с (правая панель), где существует разрыв между патч-корд и имплантируемых волоконно-оптических, так как визуально при расколе соединительной муфты. Обратите внимание на утечку света, которые могут возникнуть с неправильным подключением (внизу справа). Нижняя вставка на UPPER левой панели изображен отдельные компоненты, используемые. Сверху донизу вставки: дорического имплантируемого волоконно-оптической канюли, белый циркония сплит-рукав, плоским Клив (FC) конец черной рубашкой животных патч-корд (полный патч-кордов, изображенный на рис 3B). Во всех панелей, обратите внимание, что соединительная гильза не заподлицо с концом ФК в патч-корд. Оставить ~ 0,5 см над-повесить для подключения к имплантируемого волоконно-оптических, прикрепленной к животным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 6. Side (слева) и фронтальная (справа) вид мыши с имплантированной волоконно-оптических, подключенного к патч-корд. Используйте раскол на соединительном рукаве, чтобы помочь себе правильность подключения патч-корда TО наконечника имплантированного волоконно-оптических. Точка подключения будет выделен красным пунктирной рамки, а также изображены в верхнем вкладыше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 7. Представитель результаты. (Левый) Поведенческая считывание в естественных условиях optogenetic стимуляции. Пример поведения, которые могут быть получены с использованием описанной лазерной настройки и протокол модема. Двигательная активность была зафиксирована во время optogenetic стимуляции области вентральной покрышки (VTA) в тирозингидроксилазы (TH) :: мышей Cre (N = 7 – 8 / группа) трансдуцировали либо ступенчатая функция опсина (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) или вирус управления (AAV5-DIO-EYFP) в ВТА. Группы из трех мышей одновременно привязаны к одномулазерного как показано на фиг.4С и стимулировали с 5 сек импульса 447 или 473 нм света доставлен один раз в 15 мин. Двусторонняя повторных измерений ANOVA выявил значительную группу X Время взаимодействия (F 3,39 = 15,27, р <0,0001) и значительное Основной эффект времени (F 3,39 = 4,67, р = 0,007), при этом optogenetic стимуляция повышенной двигательной активности только у мышей SSFO (Бонферрони ретроспективном р <0,0001 по сравнению с Т = 0 – 15 раз бен), в результате общего увеличения двигательной активности по сравнению с мышами EYFP (основной эффект группы: F 1,39 = 10,69, р = 0,0061; Бонферрони ретроспективном р <0,01 при Т = 15 – 30 и р <0,001 при Т = 30 – 45 и т = 45 – 60). Волоконно характеристики: 200 мкм ядро, 0,22 нА. Свет освещенности = 6 – 66 мВт / мм 2, что соответствует волокна наконечника расстоянии 0,1 – 0,6 мм от вирусного месте инъекции с 5 мВт света, излучаемого на конце волокна до модема. Усы представляют стандартную ошибку среднего. EYFPпротив SSFO: ** р <0,01; *** Р <0,001; Время действия: #### р <0,0001 (справа) гистологического подтверждения вирусной и волоконно-оптической размещения.. Конфокальной флуоресцентной изображение, полученное на Leica TCS сканирования SP5 лазерного микроскопа для визуализации размещение волокна (пунктирная линии) и вирусно-опосредованного выражения (зеленый) в мыши вентральной области покрышки, следующих в естественных условиях optogenetic стимуляции. Допамин нейронов (TH +) рассматриваются в синий цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Видео 1. В естественных условиях optogenetic стимуляции:. Гиперактивность во VTA стимуляции с использованием SSFO у мышей TH :: Cre Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. <table border="0" cellpadding="0" cellsстимуляция = "0"> Таблица 1. Световые облучённости необходимо активировать часто используемые опсины. Opsin Вариант λ Плотность мощности (/ мм 2) Свойства ON / OFF кинетики Оптическое возбуждение: быстродействующий channelrhodopsins ChR2 2 470 1 – 5 мВт 1,21 / 12 мс Пожары до 40 Гц Чета 19 490 5 мВт 0,86 / 8,5 мс Пожары до 200 Гц Главный 20 450 1,65 мВт 1,62 / 12 мс Номера для десенсибилизирующее форма ChR2 C1V 18 540 – 630 8 мВт (540 нм) 5/34 мс при 540nm Красное смещение 3,2 мВт (630 нм) 67 мс (ON) на 630 нм Оптическое возбуждение: медленно действующий родопсины канала Стабильный ступенчатая функция опсин (SFO) 8 470/590 8 мкВт (470 нм) 20 мс / 29 мин Новый вариант SFO; больше открытое состояние. Открыта 470 нм, закрыты 590 нм Оптический Ингибирование eNpHR3.0 21 560 – 630 3 – 5 мВт 2,5 мс / <10 мс Устойчивое торможение в течение 30 мин 22 с постоянным светом * archt3.0 11, 23 520 – 560 1 5 мВт 2 > Эта таблица приводится лишь как руководство; конкретные света облучённости, необходимые для нервной модуляции, должна быть независимо подтверждены. Экспериментальное обоснование важно, чтобы убедиться, что опсин, стратегии таргетирования, а легкие параметры стимуляции модуляции нейронной стрельбы в заданном порядке 5. Плотность мощности (мВт / мм 2) относится к мощности света освещенным на данном участке мозговой ткани и не относится к мощности света, излучаемого из торца волокна. * Всегда использовать самую низкую интенсивность света возможно, особенно при длительном световой стимуляции. Таблица 1. Световые облучённости необходимо активировать часто используемые опсины. Сокращения AAV = аденоассоциированный вирус DPSS = диодной накачкой твердотельный <br/> EYFP = усиливается желтый флуоресцентный белок FC / PC = плоским расщепляют / физический контакт GFP = зеленый белок люминесцентные PBS = забуференный фосфатом физиологический раствор ПВХ = поливинилхлорид мВт = мВт NA = числовая апертура SSFO = стабильную ступенчатую функцию Opsin TH = тирозингидроксилазы TTL = транзисторно-транзисторная логика V = напряжение VTA = вентральной области покрышки

Discussion

Нынешние описано лазерные Set-взлеты и стратегии в качестве модема совместимы с широким спектром грызунов поведенческих тестов. Действительно, разнообразие поведенческих тестов были использованы следующие или сопровождение, optogenetic стимуляция естественных, которые включают эмоциональные, поведенческие задачи, поведенческих, Кондиционер, обучение и парадигмы памяти, сна, возбуждение, и с аппетитом, задачи назвать несколько (см Nieh и др. 6 для всестороннего обзора). Оптогенетика изменил способ традиционные поведенческие тесты проводятся в том, что несколько дней исследований теперь могут быть сжата в одном сеансе, в котором поведение по сравнению, в-субъектов, во время различных эпох света "на" по сравнению с "выключено" 5. Следует отметить, что поведенческие аппараты, которые содержат дверные проемы, закрытые отсеки или других препятствий, возможно, придется быть изменены, чтобы приспособить прохождение привязных волокон.

Описаны стратегии привязывать разрешение сиmultaneous стимуляция множественного мышей из одного лазера. Поэтому высокая пропускная способность optogenetic поведенческие тестирование может быть достигнуто за счет использования нескольких лазеров и оборудования для тестирования. Число животных, которые могут быть одновременно стимулированных, однако, будет ограничено максимальной мощности света, который может быть достигнут в каждой оконечности волокна. Максимальная мощность на конце волокна зависит от 1) исходного мощности лазера; 2) эффективность сочетания и 3) количество частей пучка. Для 100 мВт синего лазера с ~ 80% эффективности связи и до 4 разделений пучка (как показано на рисунке 4, в), средней мощности на конце волокна может быть в диапазоне между 5-10 мВт при использовании 200 мкм ядро, 0,22 NA волокна шнуры (NB ожидать потери передачи из вращающихся соединений должно быть <15%). Измерение светового потока на кончике волокна имеет важное значение для определения адекватной силы света для активации опсина как опсины различаются по своей чувствительности к свету и, следовательно, плотности мощности света (мВт/ Мм 2), необходимое для активации 11. Например, стабильной ступенчатая функция опсин (SSFO) выступает в качестве аккумулятора фотонов и, следовательно, требует очень мало света плотность мощности для активации (<8 мкВт / мм 2) 8. Сравните это с традиционным каналом родопсина (ChR2), что требует, как минимум, 1 мВт / мм 2 света, чтобы вызывать потенциалы действия 2. Таблица 1 содержит в качестве краткого справочника для известных минимальных легких уровнем излучения, необходимых для активизации наиболее распространенные опсины в настоящее время использовать. Наконец, надо учитывать, что свет рассеивается и поглощает, как он проходит через ткани мозга, так что больше мощности света требуется для более глубоких структур головного мозга 3. Полезно интернет-ресурс доступен на http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php , что будет рассчитать интенсивность света на разных глубинах через ткани мозга, принимая вовнимание размер сердцевины волокна, числовую апертуру, длины волны используемого света, и пусковую мощность света на конце волокна. Обстоятельный обзор теоретических принципов, лежащих в основе этих расчетов, см Foutz и др. (2012) 12. Примеры того, как применять эти принципы и расчеты для эксперимента продемонстрированы в Aravanis и др. (2007) 3 и Тай и др. (2012) 13. Выполнение этих расчетов до начала эксперимента имеет решающее значение для обеспечения адекватного света освещенности для активации опсина. Учитывая эти соображения, целесообразно приобрести более мощных лазеров для обеспечения адекватного мощности. Лазеры с мощностью в пределах 100-200 мВт, как правило, достаточно, чтобы компенсировать небольшое ядро волокон, рассеянный расщепления волокон, соединительной неэффективности и передача теряет 7. При использовании мощных лазеров, однако, следует соблюдать осторожность, чтобы избежать нервного повреждения или тепла и света-сотрудникD артефакты, которые могут возникнуть при длительном и / или высокой мощности светового облучения 7. Безопасный диапазон для экспериментов в естественных условиях до 75 мВт / мм 2. 14

Решение от типа лазера до покупки может быть сложным делом, так как есть много факторов, чтобы рассмотреть. Например, прямые диодные лазеры обеспечивают более стабильную и повторяемую импульсный выход, чем сделать твердотельные (DPSS) лазеров с диодной накачкой, и являются более надежными в течение долгого времени в лабораторных условиях. В некоторых случаях, однако, прямые диодные лазеры могут излучать более низкую мощность света, ~ 0,1 МВт, даже когда команда напряжения 0 В связи с постоянным тока смещения доводится до диода электроникой управления лазера. Это "спонтанная" эмиссия имеет более широкий спектр, чем делает лазерное излучение от лазера, так может быть специально снизить, установив узкую полосовой (или "очистки") фильтр между лазером и навесного оборудования (по специфик). Этот фильтр такжеснизить мощность на ~ 50% при генерации, так приобрести более мощных лазера соответственно. Следует отметить, что желтые DPSS лазеры чрезвычайно чувствительны и могут работать с ошибками, и снизили срок службы, если быстро модулируется генератором импульсов. Регулировка желтого мощности лазера должно быть сделано через внешний фильтр плотность колесами, на пути луча (раздел 1.7) при работе лазера в TTL + режим. Кроме того, приобретение зеленой нм DPSS лазер 532 является экономически эффективной альтернативой, которая может активировать оба halorhodopsins и archaerhodopsins.

Числовая апертура (NA) волокна важно учитывать при проектировании и покупке компонентов волокна для лазерной установки настройки. НС оптического волокна определяет углы световых лучей, которые могут быть приняты и испускаемых в наконечнике волокна. Если волокна выше-NA в паре с волокна нижнего Н.А., значительная потеря будет происходить в этом интерфейсе, так что это важно быть последовательным Wi го волокна NA в одну установку (или для того, чтобы NA растет по пути света). Эффект волокна НС по объему мозговой ткани, освещенной менее важно, так как ткани мозга крайне рассеяния, а поскольку свет в сочетании с лазерным источником будут иметь тенденцию к "не заполняют 'High-на волокна; Однако оптические волокна с NA 0,22 и 0,37, как правило, используется. Кроме того, соединения из большего процессоров на более мелкие волоконный также приведет к значительным потерям, поэтому всегда обязательно используйте увеличения или равные диаметры сердцевины, когда прогрессирует от лазерного источника к животному имплантата. На общем плане, концы волокон всегда должны быть закрытыми, когда они не используются для предотвращения попадания пыли и твердых частиц отложений. Это хорошая идея регулярно чистить концы волокон и разъемы (70% изопропиловый спирт хорошо работает), чтобы обеспечить максимальную выходную мощность света, и свет испытания мощности через «фиктивной имплантата" перед началом экспериментов каждого дня.

"> Во время тестирования поведения, необходимо принять меры для контроля последствий вирусной инфекции, выражения экзогенного белка, видимого света, а также возможных последствий ткани отопления и артефактов на поведение животных. Таким образом, надлежащий контроль группа должна состоять из животных трансдуцированную контрольного вируса (например, GFP, EYFP, mCherry), которые получают одинаковые параметры световой стимуляции. Экспериментальная проверка является решающим последний шаг в поведенческих данных, используемых для анализа полностью зависит от правильного опсина и размещения волоконно-оптической в интересующей нас области . В частности, у животных, где не обнаружено не иммуногистохимическое сигнала, или там, где размещение сигнала или волокна не находится в области, представляющей интерес, то данные о поведении на том, что животное должно быть удалено из эксперимента. Кроме того, важно, чтобы проверить световой поток на Подсказка волокна и до хирургической имплантации и снова вскрытии обеспечить достаточную мощность света для активации опсина. В анимыLs, где тяжелые потери света произошло по волокна после экспериментов (> 30%) 9, данные для этого животного должны быть рассмотрены для удаления. Критерии для удаления должны быть установлены заранее. Наконец, следует учитывать частоту импульсов, необходимое для модулирования нейронной стрельбы, которая будет зависеть от структуры мозга и нервных подтипов мишенью. Опубликованные optogenetic легкие параметры стимуляции существуют для нескольких нейронных подтипов, однако, способность модулировать нейронные стрельбы должны быть подтверждены независимыми через в естественных условиях или мозг срез электрофизиологических записей.

Как человек становится адептом с лазерным использования и модификации лазерных наборах, комбинации различных длин волн могут быть привязаны к нескольким волокон на одного животного или отправляются по одному волокну для комбинаторной Оптогенетика 8. Стимулирование Multi-длины волны будет становиться все более важным с учетом быстрого развития красного смещенияред channelrhodopsins 8, инженерия смещенных гиперполяризующих опсинов 15, использование бистабильных опсинов ступенчатая функция 8,16,17, и вообще расширения список опсинов со спектрами отличие активации 11. Это расширение optogenetic инструментов позволит беспрецедентный контроль нескольких нейронных подтипов как внутри, так и между областями мозга, чтобы определить их роль в управлении сложными поведенческими состояния.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

Materials

1. Laser Set-up
Name of Equipment Company Quantity Catalog Number Comments
100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability Omicron 1 Luxx/Phoxx 473/488-100 Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display
100mW 594nm DPSS laser Colbolt 1 0594-04-01-0100-300 04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers
200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability Shanghai Lasers 1 GL532T3-200 Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins
Non-contact style laser to multimode fiber coupler  OZ Optics 1 HPUC-23-400/700-M-20AC-11 For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded Thorlabs 1 MB1213 For dual laser system
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded Thorlabs 1 MB1012 For single laser system
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded Thorlabs 2 MB4 For blue laser; dual laser system
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped Thorlabs 4 CL3
3/4" stainless post Thorlabs 1 TR075
1" stainless post Thorlabs 4 TR1
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew Thorlabs 2 PH1
Pedestal Base Adapter Thorlabs 3 BE1
Small Clamping Fork Thorlabs 3 CF125
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror Thorlabs 3 KM100-E02
Neutral filter density wheel Thorlabs 1 NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic mirror 50% Thorlabs 1 DMLP505
Kinematic mount for 1" optics  Thorlabs 1 KM100 For dichroic mirror
20-piece hex wrench kit with stand Thorlabs 1 TC2
1/4"-20 cap screw and hardware kit Thorlabs 1 HW-KIT2
Mounting base 1" x 2.3"x3/8" Thorlabs 1 BA1S
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve Thorlabs 2 ADAFCB1 Dual FC/PC L-bracket also available
Breadboard lifting handles Thorlabs 3 BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm Thorlabs 1 FB450-10 For use with diode lasers that spontaneously emit
2. Laser Coupling
Name of Equipment Company Quantity Catalog Number Comments
! Laser protective eyewear Various One for every user at each wavelength ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser 
Fiber optic cable tester Eclipse 1 902-186N
One-step fiber connector cleaner Thorlabs 1 FBC1
Coupler patch cord (0.75 meter) Thorlabs 1 0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers For dual laser system
Coupler patch cord (0.5 meter) Thorlabs 1 0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode  For single laser system
Doric mini cube DORIC 2 DMC_1x2_FC-2FC
Compact power and energy meter console Thorlabs 1 PM100D Digital 4" LCD
C-series slim power sensor 5-500mW Thorlabs 1 S130C  Multiple detectors types are available; check with vendor
3. In vivo Optogenetic Stimulation
Name of Equipment Company Quantity Catalog Number Comments
Multimode fiber splitters FONT Canada 2 Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized  Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available
Arbitrary waveform function generator (2 channel) Rigol 1 DG1022 Can control up to 2 lasers at once
Fiber optic rotary joint (commutator) DORIC* 6 to 8 FRJ_1X1_FC-FC *Also available through Thorlabs and Prizmatix
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) DORIC 8 MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) Precision fiber Products 1 SM-CS1140S Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg)  Thorlabs 1 CAPF
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves  Thorlabs 2 CAPF1
Thick-jacketed patch cords (custom order) Thorlabs 4 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  3. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).
  4. Sidor, M. M. Psychiatry’s age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders. J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).
  5. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  6. Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors. Brain Res. 1511, 73-92 (2013).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477, 171-178 (2011).
  9. Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).
  10. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Res. 1511, 21-32 (2013).
  11. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nat Methods. 9, 159-172 (2012).
  12. Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron. J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).
  13. Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
  14. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).
  15. Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463, 98-102 (2010).
  16. Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).
  17. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).
  18. Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. J Vis Exp. , e50004 (2012).
  19. Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).
  20. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).
  21. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
  22. Goshen, I., et al. Dynamics of retrieval strategies for remote memories. Cell. 147, 678-689 (2011).
  23. Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).

Tags

OptogeneticsIn VivoCentral Nervous SystemNeural CircuitsCell-type SpecificitySpatial PrecisionTemporal ResolutionLight-sensitive Ion ChannelsOpsinsLaser StimulationTetheringBehavioral Testing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., McClung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J. Vis. Exp. (95), e51483, doi:10.3791/51483 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image