설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극
Summary
Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.
Abstract
The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.
Introduction
Optogenetics 정상과 질병 관련 행동 상태를 구동하는 신경 회로 소자에 대한 검색 시스템 수준의 신경 과학 혁명을했다. 빛에 민감한 미생물 opsins 1 기능적으로 포유 동물 세포에서 발현 될 수있는 발견은 높은 공간 및 시간 정밀도 2 신경 활동의 전례없는 제어 할 빛을 사용하기위한 플랫폼을 제공했다. 신경 활동의 수기 전통적인 전기 생리 학적 또는 약리학 적 접근 방법과는 달리, optogenetics 이종 집단 내의 생리적으로 중요한 시간 척도에 (유전 식별 또는 투영 공간에 기초하여) 특정 세포 유형의 제어를 허용한다. 신경 광학 인터페이스의 이후의 도입은 동물 (3) 행동에 빛의 전달을위한 실용적인 도구를 제공했다. 이것은 인과를 테스트하기 위해 행동하고 깨어 설치류에서 정의 된 신경 회로의 실시간 변조 허용했다신경 및 정신 질환 4-6 관련 행동 상태의 지배 구조에서 이러한 신경 회로의 역할. Optogenetics 따라서, 두뇌 활동 및 동물 모델에서 행동 또는 생리 학적 측정 사이의 함수 관계를 조사하고 관심있는 실험실에 도입하기위한 강력한 도구를 나타냅니다.
optogenetic 실험을 성공적으로 설계 및 완성은 여러 단계 및 고려 사항 (그림 1 참조)이 포함됩니다. 현재 프로토콜의 목표는 깨어 행동하는 설치류에 optogenetic 자극을 수행하는 데 필요한 이론 및 실무 지식과 함께, 도구 및 구성 요소와 개인을 제공하는 것입니다. 현재, 미생물 옵신 채널을 활성화하는 데 사용되는 두 개의 주된 파장 범위가 있습니다 푸른 스펙트럼에서 (일반적으로 473 ㎚)과 녹색 – 노란색 스펙트럼 (일반적으로 532 또는 591 ㎚). 레이저, 발광 다이오드 (LED)는 모두 D에 광원으로 사용될 수있다뇌 조직에 특정 파장의 빛을 eliver. 쥐 생체 내 자극에 필요한 작은 코어 섬유에 결합 될 때 LED에 의해 방출 된 비 간섭 성 광은, 그러나, 광 어려운 효과적인 전송한다. 적절한 레이저 어셈블리에 결정하는 것은 매우 중요한 초기 단계이며 실험실에서 optogenetics의 사용 목적에 따라 달라집니다. 선불 결합 레이저와 듀얼 레이저 시스템 (그림 2 참조) : 현재의 프로토콜은 두 조립 및 사용의 용이성에 차이가 기본 구성에 대해 설명합니다. 제조업체에서 미리 결합되어 단일 레이저 시스템은 본질적으로 바로 갈 필요없이 셋업이 거의 도착하지만 최소한의 최종 사용자 정의의 단점이있다. 듀얼 레이저 시스템은 동일한 섬유 아래 두 개의 다른 파장의 전달을 가능하게한다. 상이한 파장을 활성화하는 데 사용될 수있다 이것은 distinc 억제 / 조합 optogenetics의 출현으로 점점 더 중요해질 것이다공간적으로 공동화되어 T 세포 유형. 이것은 또한 광전류가 시작 각각 7, 8, 파란색과 노란색 빛에 의해 종료 쌍 안정 단계 기능 opsins와 함께 사용하기위한 필수적이다. 사용자가 추가하거나 필요에 따라 빔 경로의 구성 요소 (예를 들면, 외부 셔터, 광 필터, 인라인 파워 미터)를 제거 할 수있는 듀얼 레이저 시스템은 또한 사용자 정의된다. 그것의 다양성에, 듀얼 레이저 설정은 optogenetics은 실험실에서 사용되는 계속 도구가 될 것입니다 경우에 권장합니다. 레이저의 커플 링은, 그러나, 도전을 제공 할 수 있고 그래서 빠르고 쉽고 안정적인 결합기구는이 프로토콜에 제공된다. 이 프로토콜의 광학 구성 요소를 조립 및 세부 200 μm의 코어 및 0.22의 개구 수 (NA)와 스텝 인덱스 멀티 모드 섬유에 최적화 된 패치 코드 및 구성 요소를 이용하여, 참고. 다른 핵심 크기와 NA 그러나 모든 구성 요소가 이상적으로 코어의 측면에서 일치해야합니다, 구입할 수 있습니다크기와 NA는 광섬유 연결 지점에서 빛 손실을 방지 할 수 있습니다. 대안 적으로, 광섬유 연결에서, 광은 코어 큰 크기에서 작은 전달할 수있다; 및 / 또는 저급 – NA의 추가 손실없이 높은 NA 섬유에 관한 것이다.
테 더링 전략은 높은 처리량 행동 테스트를위한 여러 마우스를 동시에 자극 수 있도록 제공된다. 제공된 프로토콜 행동 테스트에 대한 만성 이식 섬유의 사용을 가정하지만 단기 자극 프로토콜에 대해 변형 될 수있다. 동일한 캐 뉼러는 약물과 같은 위치에 광파이버의 선단을 전달하기 위해 사용될 수 있기 때문에, 급성 이식 섬유, 약리학 적으로 조작 optogenetic 자극을 조합하는데 유리하다. 섬유가 반복 삽입 및 제거와 연관된 조직 손상을 감소시키고 섬유의 일관된 배치 관점에서의 정확도를 증가 만성적 주입 된 섬유의 사용은, 그러나, 높은 다중 일 행동 테스트 추천조직 조명 3. 여기에 설명 된 테 더링 구성과 함께 사용하면 동작은 안정적으로 여러 날에 걸쳐 녹화 할 수 있습니다. 섬유 주입 후 실제로 신뢰할 광 투과가보고 된 적이 9 개월 만성 자극 및 행동 시험 패러다임은, 이론적으로, 여러 일 주에 걸쳐 수행 될 수 있도록. 하드웨어 구성 요소에 대한 추가 참고 사내 만들 수 있습니다 비용 효율적인 대안과 제품을 포함, 자신의 개인의 필요에 맞게됩니다 최고의 제품에 독자의 선택을 할 수 있도록 프로토콜에 추가되었습니다. 설치 및 구현시 유용 중요 팁도 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재의 기술 레이저 셋업 및 테 더링 전략은 설치류 행동 검사의 넓은 범위와 호환됩니다. 실제로, 행동 검사의 다양한 다음 사용 또는 첨부 된, 감정, 행동 작업, 행동 조절, 학습 및 메모리 패러다임, 수면, 각성, 그리고 욕구 적 작업을 포함하는 생체 optogenetic 자극이 몇 가지 이름 (Nieh 등의 알을 참조하십시오. (6) 종합적인 검토를 위해). Optogenetics 전통적인 행동 검사가 여러 일 연구에서 수행되는 방식은 지금 행동을 비교하는 하나의 세션으로 응축 될 수 변경, 대 '오프'에 '빛의 별개의 신 (新) 시대 동안,-주제 내 5. 참고로, 출입구 장치를 포함하는 행동이 폐쇄 구획 또는 다른 장애물이 닿는 섬유의 통로를 수용하기 위해 수정 될 필요가있다.
설명 테 더링 전략 허가시하나의 레이저에서 여러 마우스의 multaneous 자극. 고효율 optogenetic 행동 테스트 따라서 여러 레이저와 테스트 장비의 사용을 통해 달성 될 수있다. 동시 자극 될 수있는 동물의 수는, 그러나, 각각의 섬유 팁에서 달성 될 수있는 최대 광 전력에 의해 제한 될 것이다. 섬유 팁에서 최대 전력 출력은 레이저의 1)을 출발 전력에 의존한다; 2) 결합 효율과 빔 분할 3) 수. 200 μm의 코어, 0.22 NA 광섬유 패치 코드를 사용하는 경우 ~ 80 %의 커플 링 효율 및 (도 4c에 도시 된 바와 같이) 4 빔 스플릿, 섬유 팁에서 평균 전력을 100 mW의 청색 레이저 5-10 mW의 사이의 범위 일 수있다 (NB <15 %가 될 로터리 조인트에서의 전송 손실을 기대). opsins 따라서 광과 광 파워 밀도에 대한 그들의 감수성에서 상이 같이 섬유 팁에서 광 출력을 측정하면 mW의 (옵신 활성화에 적합한 광 파워를 결정하기위한 필수적인/ mm 2) 활성화 11이 필요합니다. 예를 들어, 안정 단계 기능 옵신 (SSFO)는 광자 누적 역할을하기 때문에 활성화를위한 아주 작은 빛 전력 밀도 (<8 μW / mm 2)가 필요합니다 (8). 활동 전위를 유도하는 빛의 1 mW의 / mm 2의 최소 필요 전통적인 채널 로돕신 (ChR2)이 비교 2. 표 1은 현재 가장 일반적인 opsins를 활성화하는 데 필요한 알려진 최소한의 빛 irradiances에 대한 빠른 참조로 제공됩니다 사용합니다. 마지막으로, 하나는 빛의 산란을 고려하고 가벼운 힘이 깊은 뇌 구조 3에 필요한되도록 뇌 조직을 통해 이동으로 흡수해야합니다. 유용한 온라인 리소스에서 확인할 수있다 http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php 고려하여 뇌 조직을 통해 다양한 깊이에서 빛의 세기를 계산하는 것섬유 코어 크기, 개구 수, 사용 된 광의 파장, 및 섬유 팁에서 시작 광의 파워를 차지한다. 이러한 계산의 기초가되는 이론적 원칙의 훌륭한 개요, Foutz 등의 알을 참조하십시오. (2012) 12. 실험 설계에 이러한 원칙과 계산을 적용하는 방법의 예 (2007) 3. Aravanis 등 알에서 설명하고 TYE 외. (2012) 13있다. 실험을 시작하기 전에 이러한 계산을 수행하면 옵신 활성화를위한 적절한 광 방사를 보장하기 위해 중요하다. 이러한 고려 사항을 고려할 때 적절한 전력 출력을 보장하기 위해 고전력 레이저를 구입하는 것이 유리하다. 100-200 mW의 사이에 출력되는 동력 레이저는 작은 코어 섬유, 다중 섬유 분할, 결합의 비 효율성을 보상하기에 충분하며, 일반적으로 변속기는 7 잃는다. 고출력 레이저를 사용하는 경우, 그러나, 치료는 신경 손상 또는 열과 빛 – 연관 않도록주의해야장기 및 / 또는 고출력 조명 조명 (7)에서 발생할 수있는 D 유물. 생체 실험에 대한 안전 범위는 75 mW의 / mm 2에 달려있다. (14)
구매에 레이저의 종류에 결정하는 것은 고려해야 할 여러 요인이 있기 때문에 복잡한 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어, 직접 다이오드 레이저 다이오드 펌프 고체 (DPSS) 레이저를 수행하고, 실험실 환경에서 시간 경과에보다 신뢰성보다 더 안정하고 반복 펄스 출력을 제공한다. 그러나 어떤 경우에는, 직접 다이오드 레이저는 전압 지령 인해 레이저의 제어 전자 장치에 의해 다이오드로 전송되는 정전류 바이어스 0 V 인 경우에도, 낮은 광 전력 ~ 0.1 mW이었다 방출 할 수있다. 이 '자발'발광은 동일한 레이저로부터 레이저 발광을하는 것보다 더 넓은 스펙트럼을 가지며, 구체적으로 레이저 및 커플러 간의 협 대역 통과 (또는 '정리') 필터 (부품 목록 참조)를 설치함으로써 감소 될 수있다. 이 필터는 또한 것이다레이 징 할 때 50 % ~ 전력 출력을 줄일 수 있으므로 적절하게 높은 전원 레이저를 구입할 수 있습니다. 이것은 황색 DPSS 레이저는 매우 민감하며 오동작이있다 빠르게 펄스 발생기에 의해 변조 된 경우, 수명이 감소했음을 주목해야한다. 노란색 레이저 파워의 조정 TTL + 모드 레이저를 동작하면서 빔 경로 (섹션 1.7) 외부에 배치 밀도 필터 휠을 통해 수행되어야한다. 대안 적으로, 532 nm의 녹색 DPSS 레이저를 구매하는 것은 halorhodopsins 및 archaerhodopsins 모두 활성화 비용 효율적인 대안이다.
섬유의 개구 수 (NA)의 설계 및 레이저 어셈블리 셋업을위한 섬유 성분을 구매할 때 고려하는 것이 중요하다. 광섬유의 NA 허용 및 섬유의 선단에 출사시킬 수 광선의 각도를 결정한다. 높은 NA 섬유가 낮은 NA 섬유에 정합되는 경우, 상당한 손실이 그 계면에서 발생하므로 일관성 WI 것이 중요 단일 설치 내 일 섬유 NA는 (또는 NA 빛의 경로를 따라 증가 시킨다는 것을 보장하기 위해). 조명 된 뇌 조직의 체적에 대한 섬유 NA의 효과는 뇌 조직이기 때문에 고도의 산란과, 레이저 광원으로부터 결합 광에 '언더필'고 NA 섬유 경향이 있으므로, 덜 중요하다; 0.22과 0.37의 NA와 그러나 광학 섬유는 일반적으로 사용된다. 마찬가지로, 작은 코어 섬유에 더 큰 코어에서 커플 링도 상당한 손실이 발생할 때문에 항상 동물 임플란트 레이저 소스에서 진행 때 증가 또는 동일한 코어 직경을 사용해야합니다. 일반 메모에서 섬유 단부는 항상 사용하지 먼지 입자 축적을 방지하기 위해 캡핑시되어야한다. 그것은 좋은 생각이 정기적으로 청소 섬유 종료 및 커넥터 (70 % 이소 프로필 알코올이 잘 작동) 최대 광 출력을 보장하기 위해, 매일의 실험을 시작하기 전에 '더미 임플란트'를 통해 빛 출력을 테스트합니다.
"> 행동 테스트하는 동안이 단계는 바이러스 감염, 외래 단백질의 발현, 가시 광선, 및 동물의 행동에 가능한 티슈 가열 효과와 아티팩트의 효과를 제어하기 위해 수행되는 것이 중요하다. 따라서, 적절한 대조군 동물들로 구성되어야 제어 바이러스에 형질 도입 (예를 들면, GFP, EYFP, mCherry) 동일한 빛 자극 매개 변수를받을 수 있습니다. 실험 검증 분석을 위해 사용되는 행동 데이터와 같은 중요한 마지막 단계는 관심의 영역에서 적절한 옵신 및 광섬유 배치에 전적으로 의존하다 신호 또는 섬유의 배치가 관심 영역에 있지이다. 구체적으로는, 어떠한 면역 신호가 검출되지 않은 동물에서, 또는, 그 동물에 대한 다음 행동 데이터는 실험에서 제거되어야한다. 또한,이 광 출력을 테스트하는 것이 필수적이다 모두 수술 주입하고 다시 사후 전에 섬유 팁은 옵신 활성화를위한 적절한 빛 전력을 보장합니다. 애니 마에서심한 광 손실이 실험 후 광섬유를 통해 발생한 LS (> 30 %) (9)은, 그 동물 용 데이터 제거를 위해 고려되어야한다. 제거를위한 기준은 선험적으로 수립되어야한다. 마지막으로, 하나의 타겟이되는 뇌 신경 세포의 구조 및 서브 타입에 의존 할 것이다 신경 소성을 변조하는데 필요한 펄스 주파수를 고려한다. 발행일 optogenetic 광 자극 파라미터 그러나 신경 소성을 조절하는 능력은 독립적으로 생체 내 또는 뇌 슬라이스 전기 생리 학적 기록 내용을 확인해야 여러 신경 서브 타입에 대해 존재한다.하나의 레이저 사용 및 레이저 셋업의 변형에 숙달됨에 따라, 서로 다른 파장의 조합은 하나의 동물에 여러 섬유에 닿는 또는 조합 optogenetics 8 같은 섬유를 제공 할 수 있습니다. 다 파장 자극은 적색 – 시프트의 급속한 발전 주어진 점점 더 중요해질 것이다ED 8 channelrhodopsins, 블루 이동 과분극 opsins (15)의 엔지니어링, 쌍 안정 단계 기능 opsins 8,16,17의 사용과 별개의 활성화 스펙트럼 (11)와 opsins의 일반적인 확장 목록입니다. optogenetic 도구 상자의이 확장 복잡한 행동 상태를 관리하는 자신의 역할을 결정하기 위해 내부와 뇌 영역에 걸쳐 모두 여러 신경 하위 유형의 전례없는 제어를 허용합니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).
Materials
| 1. Laser Set-up | ||||
| Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
| 100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability | Omicron | 1 | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display |
| 100mW 594nm DPSS laser | Colbolt | 1 | 0594-04-01-0100-300 | 04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers |
| 200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability | Shanghai Lasers | 1 | GL532T3-200 | Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins |
| Non-contact style laser to multimode fiber coupler | OZ Optics | 1 | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11 |
| Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1213 | For dual laser system |
| Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 1 | MB1012 | For single laser system |
| Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded | Thorlabs | 2 | MB4 | For blue laser; dual laser system |
| Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped | Thorlabs | 4 | CL3 | |
| 3/4" stainless post | Thorlabs | 1 | TR075 | |
| 1" stainless post | Thorlabs | 4 | TR1 | |
| Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew | Thorlabs | 2 | PH1 | |
| Pedestal Base Adapter | Thorlabs | 3 | BE1 | |
| Small Clamping Fork | Thorlabs | 3 | CF125 | |
| Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror | Thorlabs | 3 | KM100-E02 | |
| Neutral filter density wheel | Thorlabs | 1 | NDC-50C-2M | |
| 1" Longpass dichroic mirror 50% | Thorlabs | 1 | DMLP505 | |
| Kinematic mount for 1" optics | Thorlabs | 1 | KM100 | For dichroic mirror |
| 20-piece hex wrench kit with stand | Thorlabs | 1 | TC2 | |
| 1/4"-20 cap screw and hardware kit | Thorlabs | 1 | HW-KIT2 | |
| Mounting base 1" x 2.3"x3/8" | Thorlabs | 1 | BA1S | |
| FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve | Thorlabs | 2 | ADAFCB1 | Dual FC/PC L-bracket also available |
| Breadboard lifting handles | Thorlabs | 3 | BBH1 | |
| Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm | Thorlabs | 1 | FB450-10 | For use with diode lasers that spontaneously emit |
| 2. Laser Coupling | ||||
| Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
| ! Laser protective eyewear | Various | One for every user at each wavelength | ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser | |
| Fiber optic cable tester | Eclipse | 1 | 902-186N | |
| One-step fiber connector cleaner | Thorlabs | 1 | FBC1 | |
| Coupler patch cord (0.75 meter) | Thorlabs | 1 | 0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | For dual laser system |
| Coupler patch cord (0.5 meter) | Thorlabs | 1 | 0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode | For single laser system |
| Doric mini cube | DORIC | 2 | DMC_1x2_FC-2FC | |
| Compact power and energy meter console | Thorlabs | 1 | PM100D | Digital 4" LCD |
| C-series slim power sensor 5-500mW | Thorlabs | 1 | S130C | Multiple detectors types are available; check with vendor |
| 3. In vivo Optogenetic Stimulation | ||||
| Name of Equipment | Company | Quantity | Catalog Number | Comments |
| Multimode fiber splitters | FONT Canada | 2 | Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available |
| Arbitrary waveform function generator (2 channel) | Rigol | 1 | DG1022 | Can control up to 2 lasers at once |
| Fiber optic rotary joint (commutator) | DORIC* | 6 to 8 | FRJ_1X1_FC-FC | *Also available through Thorlabs and Prizmatix |
| Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) | DORIC | 8 | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9. |
| PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) | Precision fiber Products | 1 | SM-CS1140S | Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end |
| Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) | Thorlabs | 1 | CAPF | |
| Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves | Thorlabs | 2 | CAPF1 | |
| Thick-jacketed patch cords (custom order) | Thorlabs | 4 | 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers | Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering |
Riferimenti
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