In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

! ATTENTION: Ce protocole implique l'utilisation de lasers de Classe 3B et nécessitera des directives de formation et de sécurité appropriées à prendre. lunettes de sécurité doivent être portés en tout temps lors de l'utilisation des lasers, des procédures d'alignement présentant un risque particulièrement élevé. Contactez le fournisseur de laser pour déterminer les lunettes qui fournir une atténuation maximale pour un laser donné. Si possible, se inscrire à un cours de formation à la sécurité laser institutionnel. Ne jamais faire fonctionner un laser sans lunettes de sécurité et une formation appropriées. 1. Laser Appareil Set-up Le cas échéant, les étapes du paragraphe 1 sont désignés par (A) ou (B) pour différencier les systèmes laser simple ou double, respectivement. Attacher et sécuriser des lasers pour la planche à pain. Breadboards sont d'excellents conducteurs de chaleur et agissent comme un dissipateur de chaleur pour éviter d'endommager des composants laser internes avec une utilisation prolongée. (A) Fixer le las pré-coupléer à un "x 12" planche à pain 10 (ou au besoin) à l'aide de ¼-20 "vis et rondelles capitalisation (figure 2A). Si les trous de plaque d'essais ne se alignent pas avec laser trous de montage, utiliser de petites pinces «de table» pour garantir laser pour la carte de développement. (B) Si les deux lasers à utiliser sont très différentes hauteurs de faisceaux (> ~ 1 cm), utilisez des petits 4 "x 6" maquettes pour créer une plate-forme pour l'un des lasers. Fixez ces planches aux principales grandes 12 "x 18" planche à pain en utilisant ¼-20 "les vis avec les rondelles, puis fixez le laser pour les petites cartes utilisant les vis ou crochets de la table comme le montre la figure 2B. Attachez l'autre laser directement à la carte de test utilisant les vis ou une variable table à hauteur pince. Etape critique: Breadboards, vis, et les composants optiques peuvent être achetés comme impériales ou métriques ainsi soit cohérent lorsque l'achat d'articles; la valeur par défaut pour ce protocole est impérial. (A)Joindre une épaisse enveloppe-cleave plat / contact physique (FC / PC) du cordon de raccordement au coupleur (dénommé un cordon de coupleur; voir la figure 3) qui est physiquement attaché à l'avant du laser (figure 2A). (B) Enfiler le coupleur sur un ¾ "post optique, puis époxy l'articulation entre le coupleur et le haut de la poste, en utilisant JB Kwik, ou époxy similaire, pour empêcher le desserrage et le désalignement pendant l'utilisation. Fixez le poteau à la planche à pain (comme les trous de plaque d'essais ne seront pas toujours se aligner avec la mise en place nécessaire de composants optiques, un titulaire du poste, un adaptateur de base piédestal, et de serrage de fourche sont utilisés pour sécuriser poste optique du coupleur en place). Fixer un cordon de raccordement à double paroi épaisse (coupleur épinière) à l'arrière du coupleur. (B) Insérez le premier miroir de pilotage du laser bleu dans le support cinématique, et l'attacher à la planche à pain en utilisant un ¾ "post optique. Fixez ce message à un adap de baseter et fourche de serrage. Placez la fourche de serrage et poster assemblée directement en face du laser bleu avec miroir incliné à 45 ° pour diriger le laser vers le miroir dichroïque. Utilisez le motif de grille de trous sur la carte de test d'un guide d'alignement approximatif. Une fois positionné à peu près, utiliser une vis ¼ "-20 plafond pour fixer la fourche de serrage à la carte de test (voir les figures 2B, C). (B) Insérez le miroir dichroïque dans un support cinématique et l'attacher à un "post optique 1 et le fixer directement à la planche à pain. Placez le miroir dichroïque à l'extrême gauche de, et en conformité avec, le miroir de laser bleu. Angle le miroir dichroïque à un angle de 45 ° de telle sorte que la lumière bleue réfléchie par le premier miroir se reflète dans le coupleur, puis serrer la vis de fixation du support cinématique au poste (voir les figures 2B, C). (B) Fixez le premier miroir de direction pour le laser jaune à un ¾ "post optique. Fixez le optiaprès cal à un adaptateur de base et une fourchette de serrage. Placez la fourche de serrage et post-ensemble directement en face du laser jaune et l'angle du miroir à un angle de 45 ° de telle sorte que la lumière jaune sera dirigé vers le deuxième miroir de pilotage. Fixez la fourche de serrage en place avec un ¼ "-20 vis d'assemblage et la rondelle. (B) Fixez le deuxième miroir de pilotage pour le laser jaune à un "post optique 1. Angle du miroir de telle sorte que le faisceau de lumière jaune à partir du premier miroir est réfléchi par le miroir dichroïque et dans le coupleur (figure 2C). Sécuriser le poste directement à la planche à pain et serrer la vis de fixation une fois que le miroir est inclinée de façon appropriée. Beaux ajustements miroirs seront effectués en utilisant les supports de miroir cinématiques dans une étape ultérieure. (B) Fixez une roue de filtre de densité neutre à un ¾ "post optique et placer le poteau dans un support de poste attaché à une base de montage. Fixez l'ensemble à la carte de test entre la première et soimiroirs jaunes cond utilisant un seul ¼ "-20 bouchon à vis. Cette molette est utilisée pour régler la puissance de la lumière laser jaune atteindre le coupleur. Astuce: serrer individuellement tous les composants (tels que les vis de fixation porte-miroir cinématiques en haut de poteaux et les fils retenant adaptateurs de base au fond de messages) avant de les attacher à la base. Utilisez un arbre d'une petite clé hexagonale dans les trous prévus à travers des postes-optiques pour obtenir un couple suffisant. Cela permettra d'éviter les composants se desserre pendant l'utilisation, ce qui nécessite un réalignement. Fixez un FC / PC au FC / PC adaptateur L-support à la planche à pain. Facultatif: Sécuriser un 1 x 2 50/50 mini-séparateur de fibre de cube directement à la carte de test pour la stimulation simultanée in vivo de deux ou plusieurs animaux. En outre, les poignées peuvent être ajoutés pour aider à mouvement de l'assemblage de plaque d'essais (comme on le voit sur ​​la figure 2A). 2. Couplage laser (sans contact style Couplage) Cette section concerne le double laser set-up (figure 2B). Alignez le chemin de laser bleu intérieure avant d'aligner le chemin laser jaune externe. ! ATTENTION: Utilisez un couplage de puissance faible luminosité (~ 1 mW) pour assurer la sécurité des yeux. Porter des lunettes de sécurité à la puissance du laser et jusqu'à ce que l'intensité lumineuse est mesurée et considérées comme sûres. Régler les commutateurs à l'arrière du laser à "Curr" (courant) et le mode logique transistor-transistor (TTL) + pour l'éclairage constant (par opposition au mode analogique). Assurez-vous que le bouton d'alimentation à l'avant du conducteur est fixé à zéro. Allumer le laser en tournant sur le premier conducteur et ensuite la clé de laser. Ajuster lentement le bouton d'alimentation situé à l'avant du pilote laser afin que la lumière laser ~ 1 mW est émis. Attendre 10 à 15 min (ou comme spécifié par le fabricant) pour le laser pour se réchauffer. Connectez le testeur de câble de fibre optique directement à la free extrémité du coupleur cordon de raccordement et allumez le testeur de câble (figure 3A). Ajustez l'angle du coupleur de sorte que le faisceau rouge se déplace vers l'arrière vers le centre du miroir dichroïque. La trajectoire du faisceau de la lumière rouge émise par le testeur de câble est le chemin exact que la lumière laser entrante devra suivre pour être couplé dans le laser. Effectuer un alignement grossier: Utilisez les boutons latéraux et horizontaux sur les miroirs cinématiques pour diriger le faisceau de lumière laser dans le coupleur. Peut être nécessaire de repositionner légèrement desserré les miroirs et le coupleur Les pinces de piédestal. Les supports cinématiques devraient encore avoir certains Voyage disponible pour d'autres réglages fins. Ne vous inquiétez pas si aucune lumière bleue est émise sur le patch cordon coupleur-joint à ce moment. Placez une seule feuille de papier semi-translucide directement en face du miroir dichroïque, entre le coupleur dichroïque et. Il y aura à la fois un bleu et ared point sur ce papier à partir du laser et le testeur de câble, respectivement. Utilisez du papier qui est translucide suffit de voir à la fois les taches rouges et bleues simultanément à partir du même côté du papier. Effectuer des réglages fins du premier miroir de direction (ce est à dire, le plus proche du laser, pas dichroïque) en ajustant avec soin les boutons latéraux et horizontaux pour aligner le centre du point rouge avec le point bleu. Déplacer le papier vers le coupleur de sorte qu'il est directement en face du coupleur et ajuster les commandes de la seconde (ce est-dichroïque) miroir pour aligner le faisceau laser avec le faisceau rouge. Itérer sur les étapes 2,6 et 2,7 jusqu'à ce que le centre des faisceaux bleu / jaune et rouge sont exactement aligné dans les deux positions (ie, jusqu'à ce que les poutres rouges et bleus sont colinéaires). Enlevez le testeur de câble du cordon du coupleur. La lumière laser doit maintenant être émise à partir de l'extrémité du cordon de raccordement de coupleur. Détermine efficacité de couplage en mesurant la puissance lumineuse émise par la pointe de la fibre du cordon de raccordement de coupleur à l'aide d'un wattmètre. Utilisez le réglage de 500 mW sur la photodiode de l'indicateur de puissance et de modifier le réglage de longueur d'onde (λ) au bleu (473 nm) ou jaune (635 nm) du spectre selon le laser utilisé. Placer l'extrémité de la fibre perpendiculaire à la photodiode pour obtenir une lecture de puissance. Comparer la puissance lumineuse entrant dans le coupleur de puissance de la lumière émise à partir de l'extrémité de fibre. Une efficacité de couplage de> 80% est considérée comme très bonne. Très petits ajustements supplémentaires du second miroir de direction peuvent parfois légèrement améliorer le couplage. En général, lorsque le diagramme de rayonnement de l'extrémité de la fibre de couplage est un petit serré, tache centrale (sans anneaux entourent), de rendement de couplage dans le coeur de la fibre est optimale. Répétez les étapes 2.1 à 2.11 pour le couplage laser jaune, sauf utiliser les deux miroirs de direction pour le laser jaune (voir figure 2C). Ne past régler la position du miroir dichroïque ou l'alignement du laser bleu sera perdu. 3. In vivo optogénétiques Stimulation Veiller à ce que toutes les procédures impliquant l'utilisation d'animaux sont menées conformément aux directives locales et nationales et approuvées par l'Institutional Animal Care correspondante et utilisation Comité. Fibre optique mis en place (voir la figure 3B pour l'identification des différents types de cordons de raccordement mentionnée ci-dessous). Pour stimuler une seule souris, branchez le cordon de raccordement de coupleur à un cordon de raccordement épaisse enveloppe en utilisant le FC / FC support en L adaptateur directement attachée à la carte de test (voir la figure 4A). Pour stimuler deux animaux d'un laser, connectez le coupleur cordon de raccordement à deux cordons de brassage épaisse enveloppe en utilisant le 1 x 2 50/50 mini-cube (voir la figure 4B). Pour stimuler trois ou plusieurs animaux, branchez le cordon d'attelage à un répartiteur de fibre multimode utilisant le 1 x 2 mcube ini déjà attaché à la carte de test (voir figure 4C). Joindre une / joint rotatif du collecteur aux extrémités libres de l'épaisse enveloppe séparateur cordon de raccordement / fibre. Commutateurs sont essentiels car ils permettent la rotation de la fibre avec le mouvement du rongeur, qui empêche l'accumulation de couple sur le cordon de raccordement. Trop de couple peut tordre les cordons, conduire à la rupture, et interférer avec le mouvement naturel de l'animal pendant les essais. Fixez le cordon de raccordement des animaux au collecteur. Joindre un manchon fendu la connexion à la fin du cordon de raccordement des animaux (Figure 5) de la virole de métal libre. Ne forcez pas le manchon tout le chemin jusqu'à la virole; quittent ~ 0,5 cm de manchon exposés comme ce est ce qui relie à la fibre optique implanté fixé à l'animal (figure 6). Etape critique: Achetez toujours des manches qui contiennent une scission pour permettre l'expansion du manchon sur implanté férule de fibres lors de la connexion etretrait. Trop serré d'un ajustement peut provoquer de graves traumatismes à l'animal si l'implant déloge du crâne en tentant de déconnecter le manchon de l'implant. Si cela se produit, l'animal doit être retiré de l'étude et de recevoir des soins de vétérinaire immédiate. De même, avant d'utiliser une nouvelle douille pour la première fois, «briser dans» par brancher et débrancher une virole jusqu'à ce qu'il se déconnecte de la quantité désirée de la force. Astuce: Il est facile de casser une fibre tout en retirant un manchon qui est étroitement attaché à une virole. Pour éviter cela, pousser la virole en insérant une petite tige en bois dans l'extrémité ouverte du manchon (le manche d'un coton-tige standard est la bonne taille). Connectez le pilote de laser bleu à un générateur d'impulsions en utilisant un câble BNC et tourner le générateur d'impulsions sur. Mettez des lunettes de sécurité appropriées sur. Réglez les commutateurs à l'arrière du laser en mode "Curr» et «TTL +". Assurez-vous que that le bouton d'alimentation à l'avant du conducteur est fixé à zéro andturn le laser (tourner sur le premier conducteur et ensuite la clé de laser). Ajuster le bouton d'alimentation sur la face avant du laser de sorte que 5 à 10 mW est émise à partir de l'extrémité de la fibre de cordon de raccordement pour animaux, telle que mesurée en utilisant un compteur de puissance lumineuse. 5-10 mW est un guide général – l'intensité de puissance exacte nécessaire d'affecter un volume donné de tissu doit être calculée avant le début de l'expérience, comme dans Aravanis et al 3. Mettez le laser bleu en mode "analogique" pour la stimulation in vivo. Remarque: lasers DPSS jaunes sont exploités en mode TTL + pour un éclairage constant. Attendre 10 à 15 min pour le laser se réchauffer. Retenir doucement la souris et branchez le split-manchon sur le patch animale cordon à la fibre implantable chronique (voir figure 6). Assurez-vous que les extrémités des deux fibres en contact physique avec une autre. Utilisez la scission sur le manchon de raccordement en tant quefenêtre pour visualiser un contact direct entre les deux Etape critique:. Parfois débris peuvent se accumuler sur la virole métallique de la fibre implantable de l'animal et d'interférer avec une connexion correcte. Dans ce cas, utilisez un mélange éthanol essuyer pour nettoyer délicatement l'embout sur la tête de l'animal avant la fixation. Ne forcez jamais un manchon de raccordement sur la virole car cela peut causer un traumatisme grave à l'animal. Si une connexion physique entre les extrémités des fibres ne peut être faite après le nettoyage, enlever l'animal de l'étude. Astuce: fuite de lumière peut se produire au point de connexion entre la fibre et animale cordon de raccordement implanté. Visualisation de cette lumière par les rongeurs peut présenter un confondre expérimentale 10. Chaleur gaine thermorétractable peut être attaché à des cordons de brassage et a glissé sur le point de connexion pour minimiser la lumière parasite. Laisser la souris pour récupérer pendant quelques minutes avant le début des tests comportementaux. Astuce: Delon le test comportemental à administrer, il est préférable d'habituer souris au processus de connexion et de modem 2-3 jours avant, que la manipulation nécessaire pour connecter l'animal peut induire un stress et confondre les tests comportementaux. Passer la souris dans l'appareil d'essai de comportement se assurer que le cordon de raccordement est libre de chicots. Ne jamais laisser un animal sans surveillance pendant la stimulation. Même avec l'utilisation des collecteurs, des cordons de brassage ne ont tendance à se tordre pendant de longues périodes de temps et peuvent interférer avec le test comportemental. Utiliser un générateur d'impulsion à impulsion du laser bleu à une fréquence prédéterminée qui activera l'opsine de choix. Pour une utilisation laser jaune: jaune impulsions laser avec des volets externes ou tout simplement en bloquant le trajet du faisceau avec un, non réfléchissant, ininflammable objet opaque. 4. Déposer in vivo Considérations de stimulation Cette section ne est pas destinée à être un proto completcol, mais est offert à titre indicatif pour des interventions supplémentaires qui devraient être considérés suivante vivo la stimulation dans optogenetic. À la fin d'une expérience, confirmer histologiquement de placement virale et de fibres pour l'interprétation précise des résultats comportementaux. Euthanasier animaux selon les directives institutionnelles et perfuser l'animal avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS) et 4% (p / v) de paraformaldehyde dans du PBS. Retirer implanté à fibre optique en saisissant fermement l'embout métallique exposée avec des pinces ou pinces hémostatiques. Tirez dans une douceur, mais rapidement, le mouvement. Il est important de tester l'intégrité de la fibre implantée en mesurant la sortie de lumière à la fin de chaque expérience. Post-fixer les cerveaux de paraformaldéhyde pendant au moins 24 à 48 h avant la coupe à travers la région d'intérêt. (Si vous utilisez un microtome à congélation, incuber cerveaux dans une solution de saccharose à 30% pendant plusieurs jours avant la coupe). Effectuer immunohistochimie en utilisant Standard protocoles de détection des fluorophores opsin marqués appropriés, ce est à dire, la protéine verte fluorescente (GFP), le renforcement de la protéine fluorescente jaune (EYFP) ou mCherry. Consultez le site d'expression opsine et l'implant de la fibre sous un microscope et confirmer visuellement placement approprié de l'injection de virus et l'implant sur la base de coordonnées choisies.