JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Полисом фракционирования и анализ млекопитающих Translatomes на генома масштабе

Published: May 17, 2014
doi:
10.3791/51455
, , , , , ,
1Lady Davis Institute and Department of Oncology,McGill University, 2Department of Oncology-Pathology,Karolinska Institutet, 3Goodman Cancer Centre and Department of Biochemistry,McGill University

Summary

Рибосомы играют центральную роль в синтезе белка. Polyribosome (полисом) фракционирование в градиенте плотности сахарозы центрифугирования позволяет непосредственно определить эффективность перевода отдельных мРНК на генома масштабе. Кроме того, этот метод может быть использован для биохимического анализа рибосом и полисом-ассоциированных факторов, таких как шаперонов и сигнальных молекул.

Abstract

перевод мРНК играет центральную роль в регуляции экспрессии генов и представляет собой наиболее процесс потребления энергии в клетках млекопитающих. Соответственно, нарушение регуляции трансляции мРНК считается играют важную роль в различных патологических состояний, включая рак. Рибосомы также проведет сопровождающих, которые облегчают укладку растущими полипептидами, тем самым модулировать функцию и стабильность вновь синтезированных полипептидов. Кроме того, развивающиеся данные показывают, что рибосомы служить платформой для репертуара сигнальных молекул, которые причастны к различным пост-трансляционных модификаций вновь синтезированных полипептидов, как они выходят из рибосомы, и / или компонентов аппарата трансляции. При этом, устоявшихся метод рибосомы фракционирования с использованием градиент плотности сахарозы центрифугирования описывается. В сочетании с развитой "anota" алгоритма в доме этот метод позволяет прямое определение Differential перевод отдельных мРНК на генома масштабе. Более того, этот универсальный протокол может быть использован для различных биохимических исследований, направленных на рассекают функцию рибосом-ассоциированный белковых комплексов, в том числе те, которые играют центральную роль в складывании и деградации вновь синтезированных полипептидов.

Introduction

Регуляторные сети, которые контролируют экспрессию генов были широко изучены в течение последних двух десятилетий. Подавляющее большинство из этих научно-исследовательских работ, направленных на регуляцию транскрипции, в результате чего изменения в уровнях стационарных мРНК на генома масштабе были использованы для определения так называемых "экспрессии генов" профили. Недавние исследования показывают, что уровень устойчивого состояния мРНК лишь в общих чертах соответствуют составе протеома 1,2, что указывает, что пост-транскрипционные механизмы, в том числе трансляции мРНК, играют важную роль в регуляции экспрессии генов 3,4. В самом деле, было подсчитано, что ~ 50% от уровня белка определяются на уровне трансляции мРНК в иммортализованных фибробластов мыши 5.

перевод мРНК является строго регулируется процесс, при котором мРНК транслируются в белки через организованной действий рибосом, трансфер РНК (тРНК) и аксессуаров факторов сотрудничестваmmonly называют факторов перевода (TFS) 6. Синтез белка является наиболее трудоемким процессом энергии в клетках млекопитающих 7 и, следовательно, глобальный уровень перевода мРНК корректироваться с учетом доступности питательных веществ и клеточной пролиферации ставки 8. В дополнение к изменениям в глобальных темпов перевода мРНК, различных внеклеточных стимулов (например, гормонов и факторов роста), внутриклеточных сигналов (например, уровней аминокислот) и различных видов стресса (например, ER-стресс) вызывают селективные изменения в бассейнах мРНК, которые переводится (translatome) 6. В зависимости от типа раздражителя, переводческой деятельности некоторых, но не все мРНК резко пострадавших, в результате чего изменения в протеома, которые необходимы для установки быстрого клеточный ответ 6. Эти качественные и количественные изменения в translatome, как считается, при посредничестве взаимодействия между транс-действующих факторов (например, </EM> компоненты трансляционного аппарата, вспомогательных факторов или микроРНК) и цис-элементов (элементов РНК или черт), присутствующих в выбранных подмножеств мРНК 6,9. Например, изменения в уровнях и / или деятельности, ограничивающей скорость инициации трансляции факторы eIF4E и eIF2 избирательно модулировать перевод стенограммы на основе конкретных 5'UTR особенностей 6. eIF4E и eIF2 требуются для найма мРНК и инициатора тРНК с рибосомой, соответственно 6. Увеличение eIF4E деятельности выборочно укрепляет перевод мРНК, несущих длинные и хорошо структурированный 5'UTRs в том числе распространения кодирования и выживания стимулирующего белки в том числе циклинов, С-тус и Bcl-XL 10. В свою очередь, инактивация eIF2 приводит к глобальной синтеза белка остановки, в то время как выборочно до регулирования перевод мРНК, содержащих короткие тормозные вверх по течению кадров открыт для чтения (uORFs) в их 5'UTRs, такие как те, кодирования Master Transcriptional регуляторы разложенном ответ белка (например ATF4). В ответ на различные стимулы, включая питательных веществ, факторов роста и гормонов, механистической / цели рапамицина млекопитающих (МРМ) путь стимулирует eIF4E деятельность путем инактивации 4E-связывающего белка (4E-ВР) семейный ограничителей перевода, в то время как МАРК путь непосредственно фосфорилирует eIF4E 6,11. В свою очередь, eIF2α киназы (т.е. PERK, PKR, HRI и GCN2) ингибируют eIF2 путем фосфорилирования его eIF2α регуляторной субъединицы в ответ на питательной лишения, ER-стресс и вирусной инфекции 6,12. Изменения в активности и / или экспрессии ТФ, другие компоненты аппарата трансляции и нормативных факторов, включая микроРНК были обнаружены в различных патологических состояний, включая рак, метаболические синдромы, неврологических и психиатрических расстройств, и почечных и сердечно-сосудистых заболеваний 13-19. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что трансляционным меняchanisms играют ключевую роль в поддержании гомеостаза клетки и что их отмена играет центральную роль в этиологии различных заболеваний человека.

При этом протокол для фракционирования полисом сахарозы центрифугирования в градиенте плотности в клетках млекопитающих, который используется, чтобы отделить от полисомы monosomes, рибосомных субъединиц и частиц вестник рибонуклеопротеидных (mRNPs) описывается. Это позволяет дискриминацию между эффективно переведены (связанный с тяжелыми полисом) в плохо переведенных (связанный с легкими полисом) мРНК. В этом анализе рибосомы иммобилизуют на мРНК с использованием ингибиторов элонгации трансляции, такие как циклогексимид 20 и цитозольных экстракты разделяют на 5-50% линейного градиента плотности сахарозы с помощью ультрацентрифугирования. Последующее фракционирование сахарозы градиенты позволяет изолировать мРНК в соответствии с количеством рибосом они связываются с. РНК экстрагировали из каждой фракции могут быть затем использованы для определенияизменения в распределении мРНК по всему градиенту между различными условиями, в результате чего повышается эффективность поступательные от верхней части к нижней части градиента. Нозерн-блоттингом или количественный обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) используются для определения уровней мРНК в каждой фракции.

Кроме того, тяжелые фракции, содержащие полисомы (обычно более 3-рибосомами) объедин ли и геномные полисом-ассоциированной уровни мРНК определяются с использованием микрочипов или глубоко последовательности. Это имеет первостепенное значение, чтобы подчеркнуть, что уровни полисом связанных мРНК являются, помимо перевода, зависит от транскрипции и посттранскрипционных механизмов, влияющих цитозольные мРНК уровнях 21. Поэтому для определения различий в переводе с использованием данных генома с полисом-ассоциированной мРНК необходимо для коррекции эффектов от шагов в экспрессии генов пути, которые перед трансляцииТион 21. Чтобы разрешить такую ​​коррекцию, цитозольного РНК получают параллельно с полисом-ассоциированной РНК из каждого образца и уровней мРНК стационарных генома определяются 21. В настоящее время так называемый "перевод-эффективность" (TE) результаты (т.е. лог-соотношение между полисом связанных данных мРНК и цитозольными данных мРНК) часто используются для коррекции последствий изменений в цитозольными уровней мРНК на эффективность трансляции из учитывая мРНК 22. Однако, используя TE баллы, чтобы определить дифференциальное перевод связан с значительного числа ложноположительных и отрицательных выводов в связи с математической имущества баллов ТЕ обычно называют ложной корреляции 27. Действительно обзор наборов данных из нескольких лабораториях показали, что такие ложные корреляции кажутся неизбежными при анализе изменений в translatomes 23. Это побудило развитие "анализа дифференциального тр anslation "(anota) алгоритм, который не страдает от вышеупомянутых недостатков 23. Во anota-анализа модель регрессии используется для получения меры переводческой деятельности независимо от цитозольными уровней РНК. Затем Такие меры сравниваются между условиями и статистика рассчитывается. Пользователь имеет возможность применения метода усадки дисперсии, которая улучшает статистическую мощность и уменьшает возникновение ложных положительных результатов в исследованиях с нескольких повторов 24. Важно отметить, что недавно было показано, что возмущения в translatome захвачен anota, но не забивает TE, коррелируют с изменениями в протеоме 25. Поэтому, настоятельно рекомендуется применять анализ anota для идентификации изменений в переводе на генома масштабе. Хотя были обсуждены теоретические основы алгоритма anota подробно ранее 21,23,26, здесь акцент делается на том, как применять ее на практике.

ve_content "> В дополнение к изучению изменений в переводческой деятельности мРНК в клетке, это рибосома протокол фракционирования может быть использован для выделения и биохимически и функционально охарактеризовать рибосомы и полисом связанных белковых комплексов. Такой подход был успешно развернут в прошлом, чтобы определить комплексы, которые регулируют стабильность вновь синтезированных полипептидов 27 и / или участвующих в фосфорилирования компонентов аппарата трансляции. Это применение метода полисом фракционирования также будут кратко рассмотрены.

Protocol

1. Градиента сахарозы Подготовка Подготовка 100 мл 60% (вес / объем) раствора сахарозы в DDH 2 O. Решение должно фильтруют через 0,22 мкм фильтр, чтобы предотвратить забивание трубки во время стадии фракционировани (шаг 3.5). Подготовка 5 мл 10х градиенте сахарозы буфер: 200 мМ HEPES (рН 7,6), 1 М KCl, 50 мМ MgCl 2, 100 мкг / мл циклогексимида, 1x коктейль ингибиторов протеаз (EDTA-бесплатно), 100 единиц / мл ингибитора РНКазы. Использование 60%-ный раствор полученного, как описано на стадии 1.1, сделать 40 мл 5% и 50% сахарозы решения в 1х буфере сахарозы градиента. Используйте блок Marker, поставляемый с градиентной производитель по случаю наполовину полный точку на каждом polyallomer ультрацентрифугировани трубки для наслоения (6 ультрацентрифугирования труб в общей сложности). Использование облицовочной устройство, снабженное градиента производителя, добавлять 5% раствора сахарозы, пока не достигнет наполовину полный точки. Затем добавить 50% раствора сахарозы со дна до INTERFас между двумя решениями достигает наполовину полный точки. Особое внимание должно быть принято во время этого этапа, так что градиенты как можно более близкими, как это необходимо для получения высокой воспроизводимости (см. ниже). Уплотнение трубки с курса зональных шапки, предусмотренных с градиентом производителя и передавать запаянных пробирках с держателем трубки от градиента производителя. Запустите градиента производителя получить линейную от 5% до 50% градиент. 6 линейные градиенты будут сформированы в несколько минут вращением при большом угле наклона. Примечание: градиентах сахарозы может быть использована немедленно или хранить при -80 ° С в течение 6 месяцев. 2. Выделение и Седиментация полисом В зависимости от типа клеток, семян клетки в 1-5 15-см чашки Петри (~ 15 х 10 6 клеток), по крайней мере за один день до лизиса. В день эксперимента клетки должны быть ~ 80% сливной. <!– Примечание: Оптимальное конфлюентности имеет решающее значение, потому что ставки перевод и распространения напрямуюпропорциональные 8, и поэтому полисом должны быть проанализированы в активно пролиферирующих клеток (тарифы перевод т.е. значительно снизится более чем в сливающихся клеток в то время как низкий конфлюентности клеток не может обеспечить достаточный материал для дальнейшего анализа). Исключения из этого правила могут быть сделаны, если, например экспериментатор заинтересован в изучении влияния контактного торможения на перевод. Однако клетки не должны находиться под более условиях слияния слишком долго, поскольку это может иметь непреднамеренные последствия для translatome. Если требуется трансфекции большинство коммерчески доступных наборов не влияют полисом уровней. Поскольку в день трансфекции клетки должен быть 80-90% сливной рекомендуется для распространения элементы 24 ч после трансфекции и изолировать полисом 48 ч после трансфекции из клеток ~ 80% сливной. Инкубируйте клетки с циклогексимида в конечной концентрации 100 мкг / мл питательной среды в течение 5 мин при 37 ° С и 5% СО 2; и промыть клетки дважды с 10 мл охлажденного льдом 1x PBS, содержащим 100 мкг / мл циклогексимида. Циклогексимид является ингибитором перевод удлинение, что «замораживает» рибосомы на мРНК, тем самым предотвращая рибосомы бежать 20. Очистите клетки мягко, в 5 мл ледяной 1x PBS, содержащих 100 мкг / мл циклогексимид и собирать их в 50 мл трубки. Важно, чтобы этот этап выполняется достаточно быстро, как оставляя клетки на льду в течение длительного периода времени будет резко снижают качество подготовки полисом. Сбор клеток путем центрифугирования при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в 425 мкл гипотонического буфера [(5 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 2,5 мМ MgCl 2, 1,5 мМ KCl и 1x коктейль ингибиторов протеаз (EDTA свободной)], добавляют 5 мкл 10 мг / мл CHX, 1 мкл 1 М DTT, 100 единиц ингибитора РНКазы и вихря в течение 5 секунд с последующим добавлением 25 мкл 10%-Tritoн Х-100 (конечная концентрация 0,5%) и 25 мкл 10% дезоксихолат натрия (конечная концентрация 0,5%) и вихрь в течение 5 сек. Из-за клеток опухоль, гипотонического буфера будет нарушать плазматическую мембрану, тогда как мягкие условия моющие используются для солюбилизации цитозольного и эндоплазматического ретикулума связанных рибосом, не нарушая ядерной оболочки. Центрифуга лизаты на 16000 х г в течение 7 мин при 4 ° С и супернатант передачи (~ 500 мкл) в новую пробирку предварительно охлажденный 1,5 мл. Измерение оптической плотности при 260 нм для каждого образца с использованием спектрофотометра и держать 10% от лизата в качестве входных данных, который будет использоваться для определения уровней цитозольных стационарных мРНК. Развести вклад в 750 мкл РНКазы в H 2 O, добавить 750 мкл триазол и флэш-замораживание в жидком азоте. Трансфер Ультрацентрифуга пробирки, содержащие сахарозы градиенты в предварительно охлажденной ведра ротора. Удалить 500 мкл из верхней части градиентах сахарозы. Регулировка лизатов так, что они содержат те же OD (10-20 OD при 260 нм) в 500 мкл буфера для лизиса (описано в стадии 2,5) и загружать их на каждом градиенте сахарозы. Примечание: Важно, чтобы немедленно загрузить лизатов от градиентов, поскольку это критически улучшить качество полисом препаратов. Взвешивание и балансировать каждую градиент до ультра-центрифугирования. Центрифуга при 222228 х г (36000 оборотов в минуту), в течение 2 часов при 4 ° С с использованием SW41Ti ротор. Примечание: Для того чтобы не нарушить сахарозы градиенты, "низкий" тормоз вариант должен быть выбран. 3. Полисом фракционирования и РНК Добыча Подготовьте коллектор фракций путем очистки его с теплым РНКазы свободной воды, содержащей РНКазы ZAP (несколько спрей). Повторите этот шаг с теплой РНКазы бесплатно только вода. Перейти УФ-лампы и ждать зеленый свет появляться. Осторожно снимите трубки из ротора и разместить их на льду. Включите компьютер, насос, УФ-детектора и коллектора фракций. Установите насос на 3 мл / мин и филл трубки с чеканка растворе [60% (вес / объем) сахарозы, содержащего 0,02% (вес / объем) бромфенол синий], пока не достигнет иглу. Убедитесь в том, чтобы увидеть, по крайней мере, одна капля выходит из иглы, и убедиться, что не было пузырей введен в шприце насоса или трубопровода. Поместите 2 мл пробирки в коллектор фракций. Запустите программу анализа и выбранной чувствительности до + / – 10 МэВ. Установите "развертки" на 100 сек. Расположите каждый ультрацентрифуги трубку в УФ-детектора, удостоверившись, что труба находится в ортогональной положении. Пирс трубку с иглой, крутя ручку ниже держателя трубки. Установите насос при 1,5 мл / мин и собирают фракции установки времени до 30 секунд на коллектор фракций (это приведет к ~ 750 мкл в каждой фракции). Поставьте насос в "удаленном положении", запустить насос и коллектор фракций, и в то же время начала записи с помощью DAQ трассирующими. Это позволит начать восходящую смещение сахарозы граdient и одновременное обнаружение УФ-поглощению при 254 нм. Остановить сбора, как только первая капля чеканка решения падает в собирающих трубки 2 мл. Сохранить трассировку в формате CSV и (как только шаг 3,7 завершена), с помощью электронных таблиц, выполните следующие действия, чтобы определить позиционирование каждой фракции в профиле УФ поглощения.: Выберите столбец, содержащий значения, соответствующие поглощению при 254 нм (канал 0). Создание плавной линией точечный график из абсорбции. Установите основную единицу оси Х 300 (значение, полученное делением объема 5% -50% градиент сахарозы (~ 12 мл) при времени сбора каждой фракции (30 сек). Добавить 750 мкл TRIzol в каждой фракции и флэш заморозить фракции в жидком азоте. Изолировать полисом связанных и цитозольную (с 2,6) РНК с использованием протокола тризола в соответствии с инструкциями изготовителя. Для повышения урожайности РНК, продолжить РНК Precipitation при -80 ° С в течение 30 мин или от -20 ° C в течение ночи. Примечание: Поскольку количество РНК осаждают из полисомной фракций не могут быть видны нечетко рекомендуется добавить носитель. Добавить 1 мкл носителя к трубе до стадии РНК осадков во время протокола Trizol. Определите, какие фракции соответствуют мРНК, связанной с> 3 рибосомы (используя подход, описанный 3.6) и объединять эти фракции. Используйте комплект РНК очистки выполнить очистку объединенной полисом связанных и цитозольный РНК (от 2.6). Представьте образцы на объект, чтобы определить, генома уровни мРНК с использованием микрочипов или глубоко последовательности. Если перевод специфических мРНК, должны быть проверены с помощью ОТ-количественной ПЦР, рекомендуется использовать 500 нг РНК (от объединенных фракций, содержащих> 3 рибосомы или тотальной РНК) для синтеза кДНК. Примечание: мРНК, связанные с рибосомами> 3 установлен произвольно представлять эффективно переведенные мРНК и содержат более 80% вновь синтезироватьразмера полипептиды 28,29. В том числе фракций, соответствующих света (1-2), средние (2-3) и тяжелых полисом (> 3) было бы выгодно, но это увеличит число образцов в 2 раза (4 против 2 в состоянии), и таким образом Стоимость эксперимента. Несмотря на то что ожидается, что снижение стоимости глубокой секвенирования и микрочипов анализа в будущем, должны способствовать последний подход, он сообщил, что во время проверки, распределение индивидуальных мРНК контролируется в каждой фракции. 4. Генома Анализ мРНК перевода Установите R, Bioconductor и пакет anota: Установите R (скачать с г-project.org) и начать R-сессии. Примечание: R доступен для всех операционных систем и anota будет работать на всех из них. Установите Bioconductor (bioconductor.org). R код интерпретируется через R-терминал (например, на R консоли в Windows – которая запускается делuble нажав R ярлык). Bioconductor установлены, набрав (в R-терминал): источник ("http://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite () Установите Bioconductor пакет anota (и qvalue пакет, требующий anota), набрав (в R-терминал): источник ("http://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite (с ("anota", "qvalue")) Тест, что пакет был успешно установлен и открыть руководство anota, набрав (в R-терминал): библиотека ("anota") виньетка ("anota") Примечание: Дополнительная помощь для всех функций, которые используются в пакете anota можно найти либо на веб-странице anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) или с помощью функция помощи в R. Например, чтобы получить справку по функции anotaPerformQc пойти в R-тэrminal и тип (обратите внимание, что это работает только, когда пакет anota был загружен): библиотека ("anota") # загружает пакет anota ? AnotaPerformQc # открывает помощь для этой функции Импорт данных в R: Подготовка данных выражений для анализа. Данные должны быть предварительно обработаны (например, нормализуется и контроль качества) по отношению к технике, которая была использована для измерения уровня мРНК. Входные значения должны быть войти трансформируется, наиболее распространенным является log2. Составьте одну таблицу с данными для всех полисом связанных образцов РНК и один для всех цитозольных образцов РНК. Первая колонка должна содержать генно-идентификаторы следуют один столбец данных на образец; первая строка должна включать имена для образцов. Очень важно, что таблицы имеют одинаковую заказ образца и одинаковый порядок генов. Сохраните файлы как табуляции текстовых файлов, называемых "myPolysomeData.txt" и "myCytosolicData.txt". Два класса образец В этом примере используется (контроль или больной) с 3 повторами в классе, тем самым генерируя 6 образцов с этой целью: C1, C2, C3, D1, D2, D3 в обоих файлов myCytosolicData.txt и myPolysomeData.txt. Anota требуется не менее 3 дубликатов на состоянии, когда есть два образца классы. Они должны быть независимыми биологических повторяет. Создайте каталог, который содержит входные данные файлы (myPolysomeData.txt и myCytosolicData.txt). Открыть R из этого каталога. В Windows / Mac это может быть сделано путем копирования R-ярлык в этот каталог и запуск R с помощью этого ярлыка (работая непосредственно также может быть изменен с помощью раскрывающихся меню). Создайте файл с именем myCode.R в только что созданный каталог и откройте его с помощью программного обеспечения для редактирования текста. Написать код в этом файле. Для загрузки данных в R написать следующий код в файл myCode.R (не забудьте повторно сохранить этот файл после каждого добавления кода). Ниже приводится шаг за сТЭП объяснение кода, но весь код также может быть написан изначально и функция источника (что запускает код, см. ниже) используется только один раз: # # Это загружает библиотеку anota библиотека (anota) # # Это загружает входные данные в R dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", заголовок = ИСТИНА, row.names = 1, сентябрь = " т")) dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", заголовок = ИСТИНА, row.names = 1, сентябрь = " т")) Выполните код в R, введя непосредственно в терминале R: источник ("myCode.R") Убедитесь, что данные были успешно загружены, набрав (в R-терминал): головка (dataCyto) # покажет в верхней части таблицы dataCyto головка (dataPoly) Идентификация дифференциально переведенных генов: Создать вектор, который описываеткатегории образец (вектор является одним из видов объекта в R). Этот вектор должен отражать заказ образца в myPolysomeData.txt и myCytosolicData.txt так, что все три объекта имеют одинаковый порядок образцов. Вектор будет использоваться при инструктаж anota о которых образцы для сравнения. Добавьте следующее в файл myCode.R: # # Обратите внимание, что повторных образцы имеют одинаковую пример класса # # Описания (то есть "C" или "D") в этом векторе. myPhenotypes <- C ("C", "C", "C", "D", "D", "D") Проводить оценку качества набора данных. Есть целый ряд мер качества, которые должны быть оценены до anota могут быть использованы для анализа. Они подробно описаны в руководстве anota. Добавьте этот код в myCode.R файл и сохранить: anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) Выполните код, введя в R-терминала: источник ("myCode.R") Это создаст ряд выходных файлов, которые можно рассматривать как указано в руководстве anota. Определить дифференциально переведенные гены. Образцы будут сравниваться на основе алфавитном порядке названий поставляемых данных в параметре "phenoVec" (т.е. "myPhenotypes" вектора), если они не задается пользователем (с помощью параметра «Контрасты»). Добавьте следующий код, чтобы myCode.R файл и закончить с помощью команды «источник» внутри R-терминал, как описано выше: anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) Используйте помощь для anotaGetSigGenes понять, как оutput форматируется и посмотреть, как выбрать образец категории сравнить, набрав (в R-терминал): ? anotaGetSigGenes Фильтровать и участок гены, которые по-разному переведенные. Есть несколько порогов, которые могут применяться в функции anotaPlotSigGenes и используя помощь упростит пользовательский сочетание таких порогов. Чтобы выбрать для надежной проанализированных генов применить (0.01) значения minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) и slopeP. Примечание: Кроме того, настройки, применяемые к РВМ 23,26,30 ложных обнаружения (FDR) (0.15) и сложите изменения (log 2 [1.5]) может, например, быть использованы для идентификации дифференциально переведенные гены. Другие фильтры, такие как "selDeltaPT" может быть полезно для более строгого фильтрации (например, настройки selDeltaPT к log2 [1,5]). Необходимо также указать, какие сравнения должны быть отфильтрованы (с помощью аргумента selCont). Применить описанные настройки, добавив следующую строку в myCode.Rфайла: anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) Проведение анализа с помощью функции источника от R-терминал, как описано выше. Это также генерировать графический вывод. Рассматривая этот вывод является хорошей отправной точкой для оценки эффективности анализа и определить любые необходимые изменения в настройки. Генерация выходной таблицы. Добавьте следующий код в файл myCode.R: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, файл = "MySignificantGenes.txt", сентябрь = " т") Запустите код с помощью функции источника в R-терминала. Столбцы в результирующей таблице объясняются в помощь для функции anotaPlotSigGenes.

Representative Results

МРМ является одним из основных узлов сотовой сети, которая координирует глобальные цены синтез белка с наличия питательных веществ 19. перевод мРНК регулируется в основном на ограничение скорости инициирования шаге 6. Доля рибосом, занимающихся полисом положительно коррелирует с инициации трансляции ставок 28. Примером применения метода полисом фракционирования исследовать роль MTOR сигнализации в посредничестве эффектов инсулина на трансляции мРНК представлена. С этой целью MCF7 рака молочной железы человека клетки поддерживали в низкой сыворотки и затем стимулировали в отдельности или в комбинации с активно-сайта MTOR ингибитора Torin1 инсулина. Non-стимулированные клетки, которые непрерывно держали в низкой сыворотки, служили в качестве контроля. mRNPs, monosome (80S) и полисом фракции разделении методом полисом фракционирования. По сравнению с контрольными клетками, инсулин вызвало увеличение оптической плотности в градиентных фракций, соответствующихчтобы полисом, сопровождается сопутствующим снижением поглощения в monosome фракции (рис. 1). Эти данные показывают, что доля рибосом, участвующих в полисом увеличивается в обработанной инсулина по сравнению с контрольными клетками, поэтому о том, что, как и ожидалось, инсулин стимулирует глобальные цены инициации трансляции. Torin1 вспять эффекты инсулина на профили поглощения (рис. 1), тем самым подтверждая выводы, что передача сигналов МРМ играет важную роль в обеспечении эффектов инсулина на перевод машин 19. На основе принцип, что несоответствия в градиентной подготовки нельзя избежать, вопросы были подняты в отношении воспроизводимости полученных с помощью метода 22 полисом фракционирования данных. Чтобы эмпирически проверить эту потенциально вредное вопрос, цитозольные и тяжелой полисом связанных РНК (мРНК, связанные с 4 и более рибосом) были изолированы от MCF7 клетках, обработанных только инсулина или инсулина в сочетании с Torin1 от 4-х независимых биологических повторяет (рис. 2). Эффекты инсулина и Torin1 о составе цитозольной и тяжелой полисом связанных мРНК в каждой повторности определяли на генома масштабе с использованием микрочипов подход. Для определения воспроизводимости метода полисом фракционирования метод главных компонент (PCA) был применен. Такой анализ показал, что образцы, принадлежащие к каждого условия были плотно расположены внутри двух первых компонентов в то время как различные условия были хорошо разделены (рис. 2). Эти данные показывают, что метод полисом фракционирование, как описано здесь очень воспроизводимые и, следовательно, необходимости изучать количественные и качественные изменения в переводе на генома уровне. ad/51455/51455fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg "/> Рисунок 1. Полисомной профили, показывающие влияние сывороточного голодания, инсулина и МРМ сигнализации по глобальной перевода в MCF7 клетки. MCF7 клетки были лишены питательных веществ (поддерживается в 0,1% FBS) в течение 16 часов и обрабатывают 5 нМ инсулина (INS) один или в сочетании с 250 нМ Torin1 (Ins + Torin1) в течение 4 часов. Необработанные клетки, которые непрерывно лишенные питательных веществ (0,1% FBS) были использованы в качестве контроля. Соответствующие цитозольных экстракты осаждают центрифугированием на 5-50% градиенте сахарозы. Бесплатные рибосомные субъединицы (40S и 60S), monosomes (80S) и количество рибосом в полисом фракций указаны. Рисунок 2. Генома данные, полученные с помощью рolysome профилирование высокой воспроизводимостью. MCF7 клетки обрабатывали, как на рисунке 1. цитозольного и полисом-ассоциированной РНК (> 3 рибосомы) была извлечена из 4-х независимых биологических повторяет и их генома уровней мРНК были определены с использованием GeneTitan массивы (Affymetrix). СПС была использована для оценки воспроизводимости полученных данных. Показаны первые два компонента PCA для всех процедур (Т1 = Торин 1; Ctrl = контроль; Ins = инсулин), происхождение РНК (C = цитозольного; Р = полисом связанных) и повторяет. Образцы из тех же условиях и РНК происхождения тесно расположены указанием высокую воспроизводимость.

Discussion

В этой статье описывается устоявшихся протокол полисом фракционирования с последующим способом разработаны анализа в доме для захвата качественные и количественные изменения в переводческой деятельности на генома масштабе в клетках млекопитающих. Для успешного завершения этого протокола особое внимание должно быть уделено 1) Сотовый слияния (как темпы распространения и доступность питательных веществ коррелирует с переводческой деятельности мРНК и может повлиять на состав translatome, сотовый конфлюентности должны согласовываться по повторах и экспериментальных условиях), 2) быстрого лизиса клеток (Несмотря присутствии циклогексимида и ингибиторы РНКазы в буферах, лизис должен быть быстрым и клеточные экстракты должны быть наложены на градиентах сахарозы сразу после лизиса для предотвращения деградации РНК и диссоциацию полисом), 3) Градиент препарат (для обеспечения высокая воспроизводимость данных, градиенты сахарозы должны быть получены с использованием градиента кофеваркой и SPECIAL следует позаботиться при обращении с ними).

В дополнение к изучению изменений в поступательное активности, этот протокол может быть использован для изоляции рибосом-ассоциированный белковые комплексы и создают свои физиологические функции. С этой целью уровни и положение фосфорилирование различных рибосом белков, ассоциированных может быть определена путем ТСА осадков, с последующим вестерн-блоттинга, тогда как рибосомы, связанные белковые комплексы могут быть иммунопреципитации из градиентных фракций и анализировали вестерн-блоттингом или масс-спектрометрии. Недостатком этого метода является то, что медленный метод фракция градиент может привести к диссоциации даже сильно связанных белков, связывание кинетика в быстрой ассоциации / диссоциации. Факторы, ассоциированные с вновь синтезированных полипептидов являются типичными примерами. Вновь синтезированных полипептидов возникающие образуют рибосомы может быть иммобилизован на белковых комплексов, связанных с рибосомами с использованием химических сшивающих агентов, таких как три, 3'-дитиобис [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Этот подход показал, что рецептор для активированного C киназы 1 (RACK1) / C-Jun N-концевой киназы (JNK) / эукариотических фактор элонгации трансляции 1A2 (eEF1A2) комплекс регулирует деградацию вновь синтезированных полипептидов в ответ на стресс 27. Кроме того, подобно методологии был использован в исследований, показывающих, что протеинкиназа С BII (PKCbII) набирается с рибосомами по RACK1 32 и что активация MTOR комплекса 2 (mTORC2) происходит на рибосомах, где она фосфорилирует вновь синтезированных полипептидов AKT и регулирует их Стабильность 33,34.

Основные ограничения метода полисом фракционирования с последующим анализом anota являются: 1) требование к относительно высоким числом клеток (~ 15 х 10 6 клеток), 2) отсутствие позиционной информации о локализации рибосомы на данном мРНК молекулы, и 3 ) вопросы, связанные с клеточной и молекулярной гетерооднородностью нормальных и опухолевых тканей. Вопросы, связанные с необходимого количества клеток может быть решена путем совмещения спектры поглощения пики, соответствующие monosomes (80S) клеток, чьи суммы ограничения с данными, полученными от высокого численности клеток (например, клетки HeLa) 35. Рибосомы метод профилирования (см. ниже) могут быть использованы для определения точного положения рибосомы на данной мРНК молекулы, в то время как обсуждаются вопросы, связанные с смешанных эффектов ткани неоднородности на интерпретацию изменения в экспрессии генов, полученных из сложных систем, таких как тканей человека подробно в публикации лук-порей и Стори 36.

Недавно был разработан новый рибосомы профилирования технику, в котором защищены рибосом фрагменты (РППБ) генерируются лечения РНКазы I и проанализированы глубокой последовательности 22. Этот метод позволяет определить рибосомы позиции в одной нуклеотидной разрешением, тем самым обеспечивая до сих пор unprecedented идеи в рибосомы биологии. Например, рибосома профилирование может быть использован для определения плотности рибосом на данной мРНК молекулы или идентификации элементов, что уровень перевод влияние инициации, такие как альтернативных сайтов инициации, инициирование в не-август кодонов и регуляторных элементов, таких как uORFs. Тем не менее, есть несколько методологические ограничения, которые ограничивают способность рибосом профилирования точно оценить эффективность трансляции мРНК. Они включают независимых погрешностей, вносимых случайной фрагментации и РНКазы I пищеварения, смещает введенные ингибиторов перевода (например, удлинение ингибиторы, такие как эметина и циклогексимида, вероятно, чтобы вызвать накопление рибосом на участках инициации трансляции), большое количество ложных положительных и ложноотрицательных результатов связаны с ТЕ оценки, а также их неточности в прогнозировании говорится, что происходят из белков мРНК, кодирующих 37. Возможно, самое главное, в то время какрибосома профилирование обеспечивает прямой идентификации рибосом положении на заданном мРНК молекулы, число рибосом, связанного с данной мРНК косвенно оценивается путем нормализации частоты считывает РППБ (рибосома-ассоциированной мРНК) над тем, которые наблюдались в случайно фрагментированных мРНК (всего мРНК). Например, в простой обстановке, где четыре "B" молекулы мРНК (BA, BB, BC и BD) заняты четырьмя рибосом в положениях 1, 2, 3 и 4, неотъемлемой недостаток профилирования техники рибосомы не позволит Различие между сценарии, где все 4 рибосомы ассоциировать только с Ba мРНК в положениях 1, 2, 3, и 4 и сценарии, где Ba, Bb, Bc и Bd мРНК каждый занимаемого одной рибосомы в положении 1, 2 , 3 и 4, соответственно. В отличие от этого, во время полисом фракционирования, полисом целостность сохраняется, что позволяет изоляцию пулов мРНК связанных с определенного числа рибосом (рис. 1). Это импортмуравей различие между полисом фракционирования и рибосомы профилирования позволяет предположить, что в то время как первый метод может быть использован для непосредственного сравнения мРНК в mRNP, легкой и тяжелой полисом фракции, последний метод, скорее всего, не в состоянии захватить изменения в translatome, которые вызваны мРНК, переход от легких до тяжелых полисом, а переоценить вклад тех, перейти от фракции mRNP к тяжелым полисом. Биологическое значение этих расхождений между вышеуказанными способами подчеркивается большой объем данных, показывая, что активация поступательное подмножества мРНК, таких как те, которые eIF4E чувствительных, переход от легких до тяжелых полисом, в то время как другие, такие как те, укрывательство элементы 5'TOP, вербуются для тяжелых полисом непосредственно из пулов рибосомы без мРНК 6. Интересно, что МРМ путь, как было показано одновременно модулировать перевод "eIF4E чувствительных" и 5'TOP мРНК 11. Таким образом, методологические различия, которые обсуждаются выше, могут объяснить видимое рассогласование заключения между исследований с использованием рибосомы профилирования 38,39 и полисом фракционирования 24 для оценки последствий MTOR торможения на translatome.

В заключение полисом фракционирование и рибосома профилирование являются взаимодополняющими методы, в первую очередь обеспечивают информацию относительно числа рибосом, связанных с мРНК и положение рибосомы на мРНК, соответственно. Важно отметить, что несмотря на недостатки и преимущества этих методов, она остается важным, что данные генома, полученные обеих процедур надлежащим образом проанализированы и функционально и биохимически подтверждена.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Канадского института исследований в области здравоохранения гранта (CIHR СС-115195) и FRQ-S к нему, который одновременно является получателем CIHR премия для молодых следователь; и Шведский исследовательский совет и Шведское общество Рак в ПР

Materials

HEPES Biobasic HB0264
MgCl 2 Sigma M8266
KCl VWR CABDH4532
Dithiothreitol (DTT) Biobasic DB0058
Tris Biobasic TB0196
Glycoblue Ambion AM9515 RNA precipitation carrier
Sodium Deoxycholate  Sigma D6750
Triton X-100 Sigma X100
Cycloheximide Sigma C1988
Protease inhibitor cocktail  Roche 04693132001 Tablets (EDTA-free)
RNase inhibitor  Promega N2515
0.45 µm Filter System 150 ml Corning 431155
Sucrose Sigma S0389
RNeasy MinElute Cleanup kit  Qiagen 74204 RNA cleanup kit
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 331372
Equipments
SW41Ti Rotor Package with accessories Beckman Coulter 331336
Optima L100 XP ultra centrifuge Beckman Coulter DS-9340A
ISCO fraction collector  Brandel FC-176-R1
Type II Detector with Chart Recorder Brandel UA-6 UV detector
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump Brandel BR-A86-5
UA-6 Detector Cable Brandel 60-1020-211
FC-176 Communication Cable Brandel FCC-176
Gradient Master Base Unit Biocomp 108-1 Gradient Maker
Gradient Forming Attachments Biocomp 105-914A-1R Gradient Maker attachment
Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device MicroDAQ USB-1208FS Analysis software attachment
Measurement Computing Data Acquisition Software MicroDAQ TracerDAQ Pro Analysis software (Download only)
Buffers
10X buffer for sucrose gradients:
200 mM HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2
100 µg/ml cycloheximide
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)
100 units/ml RNase inhibitor
Lysis buffer
5 mM Tris-HCl (pH7.5)
2.5 mM MgCl2
1.5 mM KCl 
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).
  3. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  4. Komili, S., Silver, P. A. Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view. Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).
  5. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  6. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  7. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).
  8. Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells. J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).
  9. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  10. De Benedetti, A., Graff, J. R. eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases. Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).
  11. Roux, P. P., Topisirovic, I. Regulation of mRNA translation by signaling pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  12. Ron, D., Harding, H. P. Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  13. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).
  14. Proud, C. G. mTOR Signalling in Health and Disease. Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).
  15. Topisirovic, I., Sonenberg, N. mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).
  16. Pavitt, G. D., Proud, C. G. Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease. Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).
  17. Abe, M., Bonini, N. M. MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact. Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).
  18. Kasinath, B. S., et al. Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).
  19. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
  23. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. Identification of differential translation in genome wide studies. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).
  24. Larsson, O., et al. Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).
  25. Colman, H., et al. Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection. J Virol. 87, 6668-6677 (2013).
  26. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).
  27. Gandin, V., et al. Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2. Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).
  28. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).
  29. Gierer, A. Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis. J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).
  30. Wright, G. W., Simon, R. M. A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments. Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).
  31. Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells. Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).
  32. Grosso, S., et al. PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1. Biochem J. 415, 77-85 (2008).
  33. Oh, W. J., et al. mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide. EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).
  34. Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. Activation of mTORC2 by association with the ribosome. Cell. 144, 757-768 (2011).
  35. Bjur, E., et al. Distinct translational control in CD4+ T cell subsets. PLoS Genet. 9, e13 (2013).
  36. Leek, J. T., Storey, J. D. Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis. PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).
  37. Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins. Cell. 154, 240-251 (2013).
  38. Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485, 55-61 (2012).
  39. Thoreen, C. C., et al. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485, 109-113 (2012).

Tags

MRNA TranslationTranslatomeRibosomePolysomeSucrose Density Gradient CentrifugationAnota AlgorithmGenome-wide AnalysisProtein FoldingPost-translational Modifications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale. J. Vis. Exp. (87), e51455, doi:10.3791/51455 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image