多聚核糖体分离和哺乳动物Translatomes分析在基因组范围内

1，蔗糖梯度准备制备100ml的60％（重量/体积）在DDH 2 O蔗糖溶液溶液应通过一个0.22微米的过滤器进行过滤，以防止在分馏步骤（步骤3.5）的管道的堵塞。 配制成5毫升10X蔗糖梯度缓冲液：200毫米HEPES（pH值7.6），1米氯化钾，50毫米氯化镁2，100微克/毫升酮，1蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA），100单位/ ml RNA酶抑制剂。 使用如在步骤1.1所述制备的60％的溶液，使加入40ml 5％和在1x蔗糖梯度缓冲液的50％蔗糖溶液。 使用随机提供的梯度制造商的标记块，以纪念半满点上的每个异质同超速离心管分层（共6个离心管）。使用设置有梯度厂商的层叠装置中，添加5％的蔗糖溶液，直到它到达半满点。然后，从下添加50％的蔗糖溶液，直到友谊赛这两个解决方案之间王牌达到半满点。应特别注意在此步骤中应采取使梯度尽可能相似，因为这是用于获得高重现必需（参见下文）。 密封管中设置有梯度壶率纬向帽和密封的管传送到所述管支架上的梯度壶。 运行梯度厂商得到线性的5％至50％的梯度。 6线性渐变将在高倾角旋转形成的几分钟。 注意：蔗糖梯度可以立即使用或储存于-80℃下进行6个月。 2，分离和多聚核糖体的沉降取决于细胞类型，细胞播种到1-5 15厘米的培养皿中（〜15×10 6个细胞）至少一天裂解之前。在实验的当天细胞应为〜80％汇合。 <!–注：由于翻译和增殖率是直接最优融合是关键比例8，因此，多聚核糖体应在活跃增殖细胞进行分析（即换算率将显著下降超过汇合的细胞，而细胞的汇合度低可能无法提供足够的材料，以便进一步分析）。此规则的例外可以举例来说如果实验者有兴趣学习接触抑制对翻译的影响作出。然而，细胞不应该被保持在了融合的条件太久，因为这可能对translatome无意影响。 如果转染是必需的，大多数的市售试剂盒的不影响核糖体的水平。因为在转染细胞的天必须在80-90％汇合时，建议繁殖细胞24小时后转染，并从细胞中分离出核糖体48小时转染后约80％汇合。 培养细胞用放线菌酮，在100微克/毫升的生长培养基中进行5分钟，在37℃和5的最终浓度％的CO 2;并用含有100微克/毫升放线菌酮溶于10ml冰冷的1×PBS洗涤细胞两次。放线菌酮是一种翻译延伸抑制剂“冻结”在mRNA的核糖体，从而阻止核糖体流失20。 刮去细胞轻轻地，在5毫升冰冷的1×PBS中含有100微克/毫升放线菌酮和它们收集在一个50毫升管。重要的是合理地快，而使细胞在冰上的长时间会大幅减少的多核糖体制剂的质量进行此步骤。 通过离心分离，在200×g离心5分钟收集细胞，在4℃下弃上清，重悬细胞于425微升的低渗缓冲液[（5毫摩的Tris-HCl（pH为7.5），2.5毫摩尔MgCl 2，1.5mM的氯化钾和1x蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）]，加入5微升10毫克/ CHX毫升，1微升的1M DTT，100单位RNA酶抑制剂和涡流5秒，然后加入25μl的10％Trito的Ñ​​X-100（最终浓度0.5％）和25微升10％脱氧胆酸钠（最终浓度0.5％）和涡旋5秒。由于细胞肿胀，在低渗缓冲液将破坏细胞膜，而温和的洗涤剂条件，用于溶解细胞质和内质网相关的核糖体，而不破坏核膜。 离心裂解物在16,000 xg下在4℃下7分钟，并转移上清液（约500微升）到一个新的预冷的1.5mL管中。测量OD 260nm处为使用分光光度计每个样品和保持将被用于确定细胞内稳态mRNA水平的裂解物作为输入的10％。淡化输入750μl，以无RNA酶H 2 O，加入750μLTrizol法和液氮冷冻闪光灯。 传输包含在预先冷却的转子轮叶蔗糖梯度超速离心管。从蔗糖梯度的顶部取下500微升。调整裂解物，使它们包含相同的外径（10-20 OD在260nm）于500μl的裂解缓冲液（在步骤2.5中所述），并将它们加载到每个蔗糖梯度。 注：重要的是要立即加载裂解液的梯度是很重要的，因为这将提高批判性核糖体制剂的质量。 权衡和超离心平衡之前，每个梯度。 离心机以222228×g离心（36000转），2小时，在4℃下用SW41Ti转子。 注：为了不破坏蔗糖梯度，应选择“低”刹车选项。 3，多聚核糖体分离和RNA提取用温暖的RNA酶含有RNA酶ZAP（几喷雾剂）自由水清洗它准备馏分收集器。只有温无RNA酶的水重复此步骤。切换紫外线灯，等待出现绿灯。 小心地从转子取出试管，并将其放置在冰上。打开电脑，泵，紫外检测器和馏分收集器。 3毫升/分钟和过滤设置泵升管与追溶液[60％（重量/体积）含0.02％的蔗糖（重量/体积）溴酚蓝]，直到它到达针。一定要看到至少一滴出来的针，并确定了无气泡泵注射器或管进行了介绍。 将2ml管中的一小部分收集器。启动分析程序，并设置灵敏度为+ / – 10兆电子伏。设置“时基”为100秒。 每个离心管放置到紫外检测器，同时确保该管是在正交的位置。通过扭转管夹持器下方的旋钮刺穿管与针。 设置泵以1.5毫升/分钟，收集馏分的时间设定为30秒的馏分收集器（这将导致在〜750μl的各馏分）。把泵在“远程位置”，启动水泵和馏分收集器，并在同一时间开始使用数据采集示踪记录。这将启动蔗糖梯度的向上位移dient和在254纳米的同时检测的UV吸光度。停止尽快的追逐解的首次下降下降在2 ml收集管收集。 除跟踪以CSV格式和（一旦步骤3.7完成），在电子表格应用程序，请执行以下操作以确定在紫外吸光度配置文件的每个部分的定位。： 选择包含​​相应的吸光度在254 nm处值的列（通道0）。 建立吸光度的流畅的线条散点图。 在X轴的主单元设置为通过每一级分（30秒）的收集时间的5％-50％蔗糖梯度（〜12ml）中的体积除以得到300（数值。 加入750微升的Trizol的每个部分和闪光灯冷冻在液氮中的级分。 根据制造商的说明书用Trizol协议隔离多核糖体相关和细胞质（2.6）+ RNA。为了提高RNA的产量，进行RNA的PRECIpitation在-80℃30分钟或-20℃过夜。 注：由于RNA的多核糖体组分的析出量可能无法清晰可见，建议添加的载体。加入1μl载体与管的Trizol协议中的RNA沉淀步骤之前。 确定（使用方法说明3.6），该部分对应于与> 3核糖体相关的基因，集中这些分数。使用RNA净化试剂盒进行的汇集多核糖体相关和细胞质的RNA（2.6）清理。提交样本的设施使用微阵列或深度测序，以确定全基因组mRNA水平。 如果特定mRNA的翻译需要通过RT-qPCR的被监测，它是推荐使用500ng的RNA（来自含有> 3核糖体或总RNA汇集部分）合成cDNA。 注：与> 3核糖体相关的mRNA被任意设定来表示有效转化基因和含有超过80％的新SYNTHE大小的多肽28,29。包括对应于光（1-2）组分，中等（2-3）和重的多核糖体（> 3）将是有利的，但是这些将增加样本数由2倍（4比2％的条件），从而使实验的成本。尽管它预计该减少深测序和基因芯片分析的成本在未来，应该有利于后者的方式，它是表示，在验证过程中，个别mRNA的分布在各个部分进行监控。 4，全基因组mRNA翻译的分析安装R，Bioconductor的和anota包： 安装R（从r-project.org下载），并开始一个R会话。 注：R是适用于所有操作系统和anota将运行于所有的人。 Bioconductor的安装（bioconductor.org）。这是由DO推出的- R的代码是通过R-端子（ 如在R控制台在Windows解释朔伊布勒一下在R快捷键）。 Bioconductor的安装通过键入（在R-末端）： 源（“http://bioconductor.org/biocLite.R”） biocLite（） 通过键入（在R-端子）安装anota Bioconductor的包（和qvalue包anota需要）： 源（“http://bioconductor.org/biocLite.R”） biocLite（C（“anota”，“qvalue”）） 测试已成功安装的软件包，并通过键入（在R-端子）打开anota说明书： 库（“anota”） 小插曲（“anota”） 注意：对于那些在anota包使用的所有功能的更多帮助可以在anota网页（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html）或使用被发现在河的帮助功能，例如，以取得该anotaPerformQc功能的帮助去到R-TErminal和类型（注意，这本anota包被加载时，只适用）： 库（“anota”）＃加载anota包 ？anotaPerformQc＃这个函数打开的帮助进口数据为R： 准备表达数据进行分析。数据应预先进行处理（ 例如，归一化和质量控制）相对于被用于测量mRNA水平的技术。输入的值必须登入改造，最常见的为log 2。编译一个表的所有的多核糖体相关的RNA样品，我为人人胞浆RNA样品的数据。第一栏应包含基因标识符后跟每个样本的一个数据列;在第一行应包含名称为样品。该表具有相同的采样顺序和相同的基因顺序是至关重要的。将文件保存为名为“myPolysom​​eData.txt”和“myCytosolicData.txt”制表符分隔的文本文件。 在这个例子中两个示例类使用（控制或患病），每类3个重复，从而产生6个样品用这个命令：C1，C2，C3，D1，D2，D3在这两个myCytosolicData.txt和myPolysom​​eData.txt文件。 Anota要求每个条件至少重复3次，当有两个示例类。这些应该是独立的生物学重复。 创建一个包含数据输入文件（myPolysom​​eData.txt和myCytosolicData.txt）的目录。从这个目录开放R。在Windows / Mac上，这可以通过复制一个R快捷键进入该目录，并使用该快捷方式启动R上进行（直接工作，也可以使用下拉菜单更改）。 新创建的目录中创建一个名为myCode.R文件，并用文本编辑软件打开它。写的代码在这个文件中。 为了将数据加载到R写入如下代码到myCode.R文件（记得每次添加代码后重新保存该文件）。下面是一个循序渐进的-S的代码，但所有代码的TEP的解释也可以写成最初和源函数（运行代码，见下文）只能使用一次： ＃＃加载了anota库库（anota） ＃＃这将加载输入数据成R dataCyto < – as.matrix（读取read.table（“myCytosolicData.txt”，标题= TRUE，row.names = 1，九月=“ t”的）） dataPoly < – as.matrix（读取read.table（“myPolysom​​eData.txt”，标题= TRUE，row.names = 1，九月=“ t”的）） 运行代码R中直接输入到R端子： 源（“myCode.R”） 检查是否已成功通过输入（到R-端子）加载数据： 头（dataCyto）＃将显示dataCyto榜榜首头（dataPoly） 鉴定差异基因的翻译： 生成一个描述矢量样品类别（向量在R中是一个类型的对象）。这个载体应该反映在myPolysom​​eData.txt和myCytosolicData.txt样品秩序，使三个对象有样品的相同顺序。指示anota样品来比较哪个当矢量将被使用。添加以下到myCode.R文件： ＃＃请注意，重复样品具有相同的示例类 ＃＃说明（ 即 “C”或“D”）在此向量。 myPhenotypes < – C（“C”，“C”，“C”，“D”，“D”，“D”） 执行数据集的质量控制。还有一些需要之前anota可用于分析，以评估质量的措施。这些中详细的anota手册论述。将此代码添加到myCode.R文件并保存： anotaQcOut < – anotaPerformQc（dataT = dataCyto，DATAP = dataPoly，phenoVec = myPhenotypes） anotaResidOut < – anotaResidOutlierTest（anotaQcObj = anotaQcOut） 通过输入到R端子运行的代码： 源（“myCode.R”） 这会产生一些输出文件，它可以检查的指示，在anota手册。 找出差异翻译基因。样品将基于除非它们是由用户（使用“对比度”参数）指定提供给“phenoVec”参数（ 即 “myPhenotypes”矢量）的名称的字母顺序进行比较。添加以下代码，使用里面的“源”命令myCode.R文件，并完成对R-端子，如上所述： anotaSigOut < – anotaGetSigGenes（dataT = dataCyto，DATAP = dataPoly，phenoVec = myPhenotypes，anotaQcObj = anotaQcOut） 使用帮助anotaGetSigGenes了解如何邻安输出的格式，看看如何选择样本类别键入（在R-端子）来比较： ？anotaGetSigGenes 过滤器和情节基因中差异翻译。有迹象表明，可以在anotaPlotSigGenes函数内申请办理，并使用帮助将简化这种阈值的自定义组合多个阈值。要选择可靠的基因分析应用minSlope（-0.5），maxSlope（1.5）和slopeP（0.01）的设置。 注意：另外，设置施加到RVM 23,26,30假发现率（FDR）（0.15）和倍数变化（LOG2 [1.5]）可以例如被用于识别差异翻译的基因。其他过滤器，如“selDeltaPT”可以是一个严格的筛选（ 例如，设置selDeltaPT到log2 [1.5]）是有用的。还需要指定哪个比较应进行过滤（通过使用selCont参数）。通过添加下面一行到myCode.R应用所描述的设置文件： anotaSigFiltered < – anotaPlotSigGenes（anotaSigObj = anotaSigOut，selContr = 1，minSlope =（-0.5），maxSlope = 1.5，slopeP = 0.01，maxRvmPAdj = 0.15，minEff = LOG2（1.5），selDeltaPT = LOG2（1.5）） 通过使用源函数从执行分析的R端子，如上所述。这也将产生一个图形输出。检查这个输出是一个很好的起点，以评估分析的性能和识别任何必要的更改设置。 产生一个输出表。下面的代码添加到myCode.R文件： write.table（anotaSigFiltered $ selectedRvmData，文件=“MySignificantGenes.txt”，九月=“ t”的） 用在R-端子源函数运行的代码。在结果表中的列在帮助中anotaPlotSigGenes功能进行了说明。