Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster gibi spontan lokomotor aktivite gibi davranışları etkileyen genetik veya çevresel manipülasyonlar okuyan yararlıdır. Burada kızılötesi ışınları ve spontan lokomotor aktivitesini ölçmek için veri analiz yazılımı ile monitör kullanan bir protokol açıklar.
Abstract
Drosophila melanogaster davranışını etkileyen çevresel ve genetik manipülasyonlar incelemek için mükemmel bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Böyle bir davranış, spontan lokomotor faaliyettir. Burada Drosophila nüfus monitör ve bir anda birkaç gün sineklerin spontan lokomotor aktivitesinin sürekli izlenmesini sağlayan bir izleme sistemi kullanır bizim protokol açıklar. Bu yöntem, basit, güvenilir ve objektif ve yaşlanma, cinsiyet, gıda kalori içeriği değişim, ilaç eklenmesi, ya da insan hastalıkları taklit genetik manipülasyonlar etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Meyve sinekleri, Drosophila melanogaster, bu tür öğrenme ve bellek, sosyal etkileşim, saldırganlık, uyuşturucu, uyku, duyusal fonksiyon, kur, ve 1,2 çiftleşme gibi karmaşık davranışlar, altında yatan mekanizmaları incelemek için değerli bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Birden protokoller aracılığıyla çalışılmıştır tek davranış spontan lokomotor faaliyettir. Negatif geotaxis Drosophila aktivitesini ölçmek için geliştirilen ilk yöntemlerden biri, ve bu protokol sinekler kap 1,3 dibine çalkalanmıştır sonra şişe belli bir yüksekliğe ulaşmak sinekler yüzdesini ölçmek içerir. Bu yöntem, basit ucuz olma avantajları vardır, ve o herhangi bir laboratuvarda yapılabilir herhangi bir özel ekipman gerektirmez beri. Bu sinek hareketlilik 3 farklı genetik manipülasyonlar etkilerini incelemek için değerli bir tarama aracı olarak kullanılmıştır. Ancak, zaman ve emek yoğun bir olduğunund nedeniyle şişelere ve insan kayıtların değişken sarsılmaya önyargı imkanına sahiptir.
Negatif geotaxis yöntem altına sineklerin sallayarak izleyen sinek şişeleri fotoğraflarını alır Rapid Iterative Negatif Geotaxis (HALKA) yönteminin 4,5, gelişimi ile üzerine geliştirildi. Bu protokolün avantajı duyarlılık ve aynı zamanda uçucu şişelerin, çok sayıda test olasılığıdır. Ancak, bu protokol hala insan hatası için potansiyele sahip ve sadece negatif Geotaxis ölçer. Diğer laboratuarlar lokomotor aktivitesini 6 belirlemek için kültür şişeleri basit gözlem kullandık.
En son sinek lokomotor etkinliği ölçmek için birçok video kayıt sistemleri geliştirilmiştir. Bir video izleme protokol 7 kaydetmeden önce ayarlama için zaman sağlar. Slawson ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bir yöntem. Da movemen durdurmak için bir hava sinyali kullanırpotansiyel olarak hayvanlara 7'ye stres olabilir kaydın başlamasından kadar t. Bu yöntem, ortalama hız, maksimum hız, hareket zamanı harcama, vb başka bir üç boyutlu izleme sistemi ücretsiz bir uçuş kalkış 8 ~ 0,2 saniye süresince bireysel sineklerin maksimal hızını ölçen hakkında bilgi sağlar. Üç boyutlu bir video izleme protokol GFP ve uçucu hareket 9 belirlemek için flüoresans saptanması için izin filtreler ile donatılmış birden fazla kamera ifade sinekler kullanır. Bu protokolde sinekler bağlı Drosophila kültür şekline potansiyel olarak silindirik bir uçuş desenler, sergileme eğilimindedirler 10 şişeler. Bu yöntem iki sinek 11 spontan hareketinin ölçülmesi sağlayan bir kubbe ile geliştirildi. Otomatik olarak izlemek ve Drosophila bireysel ve toplumsal davranışlarını ölçmek için bir kamera kullanır yüksek verimli yöntem de 12 tarif olmuştur. Zou etark. içme, yeme, uçan, hareketli, ömür boyu davranışını ve dinlenme gibi hareketleri kaydetmek için iki bilgisayar destekli kameralar kullanır, ya da bireysel tephritid meyve ölümleri 13 uçar bir davranış monitör sistemi (BMS) geliştirdi. Birkaç diğer video sistemleri sinek davranış etkinliğini 14,15 izlemek için geliştirilmiştir.
Burada nüfus monitörleri kullanan Drosophila aktivitesinin saptanmasına yönelik bir metodu tarif etmektedir. Bu monitörler 12 saatlik bir gündüz-gece ışık döngüsü 25 ° C sıcaklık ve nem kontrollü kuluçka yerleştirilmiştir. Her nüfus monitör üç farklı kademeye yüzük yerleştirilen kızılötesi ışınlar vardır. Bir sinek halkaları üzerinde hareket eder, her zaman bağımsız kayıtları bir mikroişlemci tarafından kaydedilen ve şişenin içindeki sineklerin aktivitesini sayar kızılötesi ışınını keser. Bir işlemci, kullanıcı tanımlı interva de bilgisayara şişe içinde toplam aktivitesi yüklermı bu 1 saniye ile 60 dakika değişebilir. Burada anlatılan yöntemi, sinekler yeni ortama uyum için yeterli zaman sağlar ve sinekler 120 kadar nüfus spontan lokomotor aktivitenin aynı anda ölçülmesini sağlar. Buna ek olarak, biz, gıda hazırlanmasını tarif bakım sinek, hareketlilik nüfus sıcaklık kontrollü kuluçka monitör ve sonuçlarını etkileyebilecek potansiyel faktörler kurma. Bu yöntem, farklı çevresel veya genetik değişiklikler sineklerin spontan lokomotor aktivitesini nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sineklerin spontan lokomotor aktivite, yaş, genetik arka plan, cinsiyet ve 2,13,18,19 gibi pek çok faktör tarafından etkilenir. Buna ek olarak, gıda, ortamın sıcaklığı, farklı ilaçların eklenmesi ve gece / gündüz, ışık çevriminin kalori içeriği gibi çevresel faktörler sinek aktivitesini etkileyebilir. Örneğin, aynı yaştaki kadınlarda erkek sinekler (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir kendiliğinden fiziksel aktiviteye sahiptir. Bu nedenle, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (BR AG023088) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Sucrose FCC Food Grade 100 LB, | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90471380 | |
| Brewer’s Yeast | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90331280 | |
| Drosophila Agar Fine | SciMart | DR-820-25F | |
| Cornmeal | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90141125 | |
| Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept | Sigma | H5501-5KG | |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Active Dry Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Fly CO2 pad | LabScientific | BGSU-7 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | |
| Drosophila carbon dioxide (CO2) tank | Airgas | UN1013 | |
| Small paint brush for pushing the flies | |||
| Shell vial wide | Fischer Scientific | AS519 | |
| Buzzplugs for wide plastic vials | Fischer Scientific | AS275 | |
| Glass vials (25x95mm) | Fischer Scientific Kimble 60931-8 | AS-574 | |
| Sponge plugs for glass vials | SciMart | DR-750 | |
| Drosophila Food Dispenser | Applied Scientific (Fischer Scientific) | AS780Q | |
| DPM Drosophila Population Monitor | Trikinetics Inc. | ||
| DC Power Supply with line cord | Trikinetics Inc. | ||
| PSIU9 The Power Supply Interface Unit | Trikinetics Inc. | ||
| Telephone cables and 5 way splitters | Trikinetics Inc. | ||
| Universal Serial Bus (USB) hardware | Trikinetics Inc. | ||
| Macintosh or Windows PC with UCB port | |||
| DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Macintosh | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| USB software (PSIUdrivers.zip) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem Notes 308 | (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf |
Riferimenti
- Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
- Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p., Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
- Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
- Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
- Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
- Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
- Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
- Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
- Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
- Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
- Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
- Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. . Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, (2010).
- Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).
