Summary

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em> Drosophila melanogaster</em

Published: April 10, 2014
doi:

Summary

Drosophila melanogaster zijn nuttig bij het ​​bestuderen van genetische of ecologische manipulaties die gedrag zoals spontane motorische activiteit beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol dat monitoren met infrarood stralen en data analyse software om spontane bewegingsactiviteit kwantificeren gebruikt.

Abstract

Drosophila melanogaster is gebruikt als een uitstekend modelorganisme milieu en genetische manipulaties die beïnvloedende bestuderen. Een dergelijk gedrag is spontaan bewegingsactiviteit. Hier beschrijven we ons protocol dat Drosophila bevolking monitoren en een tracking systeem dat continue monitoring van de spontane bewegingsactiviteit van vliegen zorgt voor meerdere dagen tegelijk gebruikt. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar en objectieve kunnen worden gebruikt om de effecten van veroudering, geslacht, veranderingen in calorische voedsel toevoeging van drugs, of genetische manipulaties die menselijke ziekten nabootsen onderzoeken.

Introduction

Fruitvliegen, Drosophila melanogaster, zijn gebruikt als een waardevol model organisme om onderliggende mechanismen van complexe gedragingen, zoals leren en geheugen, sociale interactie, agressie, druggebruik, slaap, sensorische functies, verkering, en paring 1,2 bestuderen. Een gedrag dat is onderzocht door middel van meerdere protocollen is spontane bewegingsactiviteit. Negatieve geotaxis was een van de eerste methoden ontwikkeld voor het meten Drosophila activiteit en dit protocol omvat het meten van het percentage van vliegen die een bepaalde hoogte van de flacon bereiken na vliegen werden geschud om de bodem van de houder 1,3. Deze methode heeft voordelen dat ze eenvoudig, goedkoop, en omdat het geen speciale apparatuur kan in elk laboratorium worden verricht. Het is gebruikt als een waardevolle screening instrument om de effecten van verschillende genetische manipulaties op vlieg mobiliteit 3 bestuderen. Het is echter tijd en arbeidsintensief eennd de mogelijkheid van vertekening door variabele schudden van de flesjes en menselijke opnamen.

De negatieve geotaxis methode werd verbeterd door de ontwikkeling van de negatieve methode Rapid Iterative geotaxis (RING) 4,5, die foto's van de vlieg flesjes na het schudden van de vliegen naar de bodem neemt. Het voordeel van dit protocol is de gevoeligheid en de mogelijkheid van het testen van een groot aantal vliegen flacons tegelijkertijd. Echter, dit protocol heeft nog steeds het potentieel voor menselijke fouten, en alleen meet negatieve geotaxis. Andere laboratoria hebben eenvoudige observatie gebruikt in cultuur flesjes om bewegingsactiviteit 6 bepalen.

Recent zijn ontwikkeld verschillende video-opname systemen voor het meten van fly bewegingsactiviteit. Een video-monitoring protocol voorziet tijd voor aanpassing voor de opname 7. De methode beschreven door Slawson et al.. Maakt ook gebruik van een lucht-puls naar movemen stoppent tot de start van de opname, die mogelijk een stressor de dieren 7 zijn. Deze methode geeft informatie over gemiddelde snelheid, maximum snelheid, tijd doorbrengen in beweging, enz. Een andere driedimensionale tracking systeem meet de maximale snelheid van individuele vliegen tijdens ~ 0.2 seconden van de vrije vlucht opstijgen 8. Een drie-dimensionale videobewaking protocol gebruikt vliegen die GFP en meerdere camera's uitgerust met filters waardoor detectie van fluorescentie te vliegen mobiliteit 9 bepalen. Vliegen in dit protocol meestal cilindrisch vluchtpatronen, die potentieel vertonen door de vorm van Drosophila cultuur flacons 10. Deze werkwijze werd verbeterd door een koepel, waardoor metingen spontane beweging van twee vliegen 11. Een high-throughput werkwijze die een camera gebruikt om automatisch volgen en kwantificeren individuele en sociale gedrag van Drosophila is ook beschreven 12. Zou etal.. ontwikkelde een gedrags-monitor systeem (BMS) dat twee computerondersteunde camera's gebruikt om de levensduur gedrag en bewegingen zoals rust nemen, bewegen, vliegen, eten, drinken, of dood van individuele Tephritid fruitvliegen 13. Verscheidene andere video systemen zijn ontwikkeld om fly gedragsactiviteit 14,15 bewaken.

Hier beschrijven we een methode voor het kwantificeren van Drosophila activiteit die bevolking monitoren gebruikt. Deze monitors zijn gehuisvest in temperatuur en vochtigheid gecontroleerde incubator bij 25 ° C op een 12 uur dag-nacht lichtcyclus. Elke populatie monitor heeft infraroodstralen geplaatst in ringen zich op drie verschillende hoogtes. Telkens een vlieg beweegt over de ringen onderbreekt de infraroodstraal die wordt geregistreerd door een microprocessor die onafhankelijk platen en telt de activiteit van vliegen in de flacon. Een microprocessor uploadt de totale activiteit in de flacon om de computer op door de gebruiker gedefinieerde intervaIs dat kan variëren van 1 seconde tot 60 minuten. De hier beschreven methode biedt voldoende tijd voor vliegen te passen aan de nieuwe omgeving en toelaten om gelijktijdig meten van de spontane bewegingsactiviteit van wel 120 populaties vliegen. Daarnaast beschrijven we de bereiding van het eten, vliegen onderhoud, het opzetten van de mobiliteit van de bevolking monitoren in temperatuur gecontroleerde incubators, en mogelijke factoren die de resultaten kunnen beïnvloeden. Deze methode kan worden gebruikt om te bestuderen hoe verschillende modificaties milieu of genetische invloed spontane locomotorische activiteit van de vliegen.

Protocol

Opmerking: Het kanton-S stam is de standaard wild-type achtergrond lijn verkregen uit de Bloomington Stock Center. 1. Voedselbereiding en Recept voor 1000 ml of Food Opmerking: Dit hoofdstuk beschrijft het protocol voor voedselbereiding. Grote metalen potten worden gebruikt voor de bereiding ongeveer 18 L voedsel tegelijk. De hier beschreven protocol wordt verkleind en gebruikt 1000 ml H2O Voedsel tweemaal geautoclaveerd. Meng 113 g sucrose …

Representative Results

De spontane bewegingsactiviteit in Drosophila hangt af fly geslacht (figuur 3A), calorie-inhoud van het voedsel (Figuur 3B) en de licht / donker-cyclus. Zodra het licht wordt uitgeschakeld fly activiteit drastisch afneemt. Figuur 3A toont 24 uur van bewegingsactiviteit opnames van mannelijke en vrouwelijke vliegen. Een sterretje op de x-as geeft de tijd dat het licht werd uitgeschakeld en de overgang naar donker cyclus. Figuur 3B illustre…

Discussion

Spontane bewegingsactiviteit van vliegen wordt beïnvloed door vele factoren, zoals leeftijd, genetische achtergrond, 2,13,18,19 en geslacht. Daarnaast kunnen omgevingsfactoren zoals calorie-inhoud van het voedsel, de temperatuur van de omgeving, toevoeging van verschillende drugs, en dag / nacht licht cyclus fly activiteit beïnvloeden. Zo mannelijke vliegen van dezelfde leeftijd een hogere spontane fysieke activiteit dan bij vrouwen (figuur 1). Daarom moet vliegen van dezelfde leeftijd en g…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (AG023088 naar BR).

Materials

Sucrose FCC Food Grade 100 LB, Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90471380
Brewer’s Yeast Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90331280
Drosophila Agar Fine SciMart DR-820-25F
Cornmeal Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept Sigma H5501-5KG
EtOH Pharmco-AAPER 111000200
Active Dry Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Fly CO2 pad LabScientific BGSU-7
Stereo Microscope Olympus SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank Airgas UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide Fischer Scientific AS519
Buzzplugs for wide plastic vials Fischer Scientific AS275
Glass vials (25x95mm) Fischer Scientific Kimble 60931-8 AS-574
Sponge plugs for glass vials SciMart DR-750
Drosophila Food Dispenser Applied Scientific (Fischer Scientific) AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Macintosh www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip) www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308 (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf

Riferimenti

  1. Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
  2. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
  3. Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p., Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
  4. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  5. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
  6. Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
  7. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
  8. Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
  9. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
  10. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
  11. Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
  12. Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  13. Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
  14. Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
  15. Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
  16. Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
  17. Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
  18. Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
  19. Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
  20. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
  21. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  22. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
  23. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
  24. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. . Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, (2010).
  25. Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).
check_url/it/51449?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449, doi:10.3791/51449 (2014).

View Video