Tilstedeværelsen af højrisiko-HPV i hoved og hals tumor væv er forbundet med gunstige resultater. Den nyligt udviklede RNA in situ hybridisering teknik kaldet RNAscope giver mulighed for direkte visualisering af HPV E6/E7 mRNA i FFPE vævssnit.
Den "gyldne standard" for onkogen HPV opdagelse er demonstration af transkriptionelt aktiv høj-risiko HPV i tumorvæv. Men detektion af E6/E7 mRNA ved kvantitativ revers transkription polymerase chain reaction (qRT-PCR) kræver RNA ekstraktion som ødelægger tumorvæv sammenhæng kritisk for morfologisk korrelation og har været vanskeligt at blive vedtaget i almindelig klinisk praksis. Vores nyligt udviklede RNA in situ hybridisering teknologi, RNAscope, tillader direkte visualisering af RNA i formalin-fikseret, paraffinindstøbt (FFPE) væv med enkelt molekyle følsomhed og enkelt celle opløsning, hvilket giver meget følsom og specifik analyse in situ af enhver RNA biomarkør i rutinemæssige kliniske prøver. Den RNAscope HPV assay blev designet til at detektere E6/E7 mRNA syv højrisiko HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 og 58) under anvendelse af en pulje af genotype-specifikke prober. Det har vist fremragende følsomhedog specificitet mod den nuværende "gold standard" metode til påvisning af E6/E7 mRNA ved QRT-PCR. HPV-status bestemmes af RNAscope er stærkt prognostisk af det kliniske resultat i svælg kræftpatienter.
Højrisiko-human papillomavirus (HR-HPV) infektion udgør ca 5% af alle kræfttilfælde i hele verden 1. Forekomsten af HPV-associeret svælg kræft er steget i løbet af de seneste årtier, især blandt mænd. HPV-positive oropharyngeal planocellulært karcinom (OPSCC), vil sandsynligvis udgøre et flertal af alle hoved og hals kræft i USA i de næste 20 år 2. Svælg planocellulært karcinom er forårsaget af HPV er forbundet med gunstige overlevelse, og tumor HPV-status er en stærk og uafhængig prognostisk faktor for overlevelse 3.
Beviser for transskriptionsaktivering af de virale onkogener E6 og E7 betragtes som den gyldne standard for tilstedeværelsen af klinisk relevant HPV 4. Men detektion af E6/E7 mRNA fra frisk tumorvæv ved RT-PCR teknik er ikke praktisk i almindelig klinisk praksis og er blevet begrænset til forskningslaboratorier. For nylig har vi HAVe udviklet en ny RNA ISH teknologi kaldet RNAscope, som gør det muligt multiplex opdagelse i individuelle celler med enkelt RNA-molekyle følsomhed i formalin, paraffinindstøbte vævsprøver (FFPE) 5-10. Vi gav tre linjer af beviser for enkelt molekyle detektion 5.. Først RNAscope sonde design og signal forstærkersystem tilladt påvisning af enkelt kopi HER2 genomiske DNA-mål i HeLa-og SK-BR-3-cellelinjer. Sekund, sammenlignet med HER2 genomiske DNA-signaler, fordelingen af de fluorescerende intensiteter af HER2 mRNA signal prikker i HeLa-celler var i overensstemmelse med et molekyle pr prik. For det tredje er antallet af HER2 mRNA signal dots per celle matches nøje HER2 mRNA kopiantallet estimeret ved en opløsning kvantificering assay yderligere støtte enkelt molekyle detektion. Desuden kontrastfarvning af kerner med DAPI i fluorescerende mikroskopi eller med hæmatoxylin i lyse-field mikroskopi tillader visualisering af enkelte kerner, WHich gengæld tillader påvisning og kvantificering af RNA-mål på en enkelt-celle basis 10. Evnen til at analysere genekspression in situ i rutinemæssige kliniske prøver gør RNAscope en lovende platform for diagnostisk patologi, især de FFPE vævssnit assays 10,11. Vi har udviklet en RNAscope baseret HPV-assay til påvisning af E6/E7 mRNA syv højrisiko HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 og 58) under anvendelse af en pulje af genotype-specifikke prober. Vores seneste undersøgelser i OPSCC har vist, at RNAscope HPV-analysen er meget følsom og specifik bestemme HPV-status på FFPE væv 12-17, og også informerer prognose i OPSCC 12,16.
Princippet i RNAscope teknologi er tidligere blevet beskrevet 5. Her beskriver vi den komplette RNAscope assayprotokollen og demonstrere dens anvendelse i detektion af HR-HPV i FFPE tumor vævssnit.
Den RNAscope HPV-analysen er tilladt direkte visualisering af E6/E7 mRNA in situ i HPV-associeret hoved og hals pladecellekræft. Den RNAscope analysen er fuldt kompatibel med rutinemæssigt fast tumorvæv og bevarer vævsmorfologi for histopatologiske korrelationer (figur 2). En vigtig fordel ved RNAscope analysen i forhold til konventionelle CISH metoder er, at det er specielt forstærker hybridiseringssignalerne (figur 2B og 2E), uden at forstærke baggrundsstøjen (figur 2C og 2F).
I praksis kan det RNAscope HPV assayproceduren være afsluttet inden for 8 timer eller bekvemt fordelt over to dage. Den RNAscope HPV-analysen er blevet brugt til at bestemme HPV-status i hoved og hals planocellulært karcinom 12-16, viser 97% sensitivitet og 93% specificitet ved hjælp qRT-PCR som referencemetode 16. Konventionel chromogenic ISH for HR-HPV-DNA er meget specifik, men har en følsomhed på ~ 80% 12. Immunhistokemisk (IHC) farvning for den cellulære surrogat markør P16 demonstrerer fremragende følsomhed, men kan generere falske positive resultater 15,18, især i nonoropharyngeal hoved og hals kræft 15. Den nuværende "gold standard" metode til qRT-PCR for HPV E6/E7 mRNA detektion kræver frisk frosset væv for optimale resultater og er teknisk kompliceret, som begrænser brugen til forskningen eneste laboratorium. Desuden kræver det RNA-ekstraktion, som gør det umuligt at korrelere HR-HPV E6/E7 mRNA-ekspression med histopatologi.
Der er flere kritiske faktorer for succes RNAscope analysen. Først, for de bedste resultater, bør der fastsættes væv i frisk 10% neutral bufferet formalin ved stuetemperatur i 16-32 hr efter ASCO / CAP retningslinjer 19. For det andet er HybEZ ovnen stærkt anbefales, da det gør det muligts optimal styring af temperatur og luftfugtighed for probehybridisering og signal amplifikationstrinnene. For det tredje er det vigtigt at fjerne overskydende resterende buffere før hvert trin, men stadig holde vævssnittet fra tørring under nogle af disse trin.
Den manuelle RNAscope beskrevet her har været fuldt automatiseret på et kommercielt slide auto-farvning systemet 10. Dette skulle i høj grad lette standardisering af assay betingelser og spare kostbar manuel arbejdskraft i kliniske patologi laboratorier. Derudover har dedikeret billede analyse software er udviklet 10 til automatisk at identificere de celler og farvningsteknikker signaler på en digitaliseret dias, som skal bidrage til at fjerne subjektivitet og forbedre reproducerbarhed i scoring.
Sammenfattende RNAscope HPV-analysen detekterer tilstedeværelsen af HR-HPV E6/E7 mRNA udskrifter in situ i FFPE væv. Det har en arbejdsgang, der er velkendt for klinisk patologi laborarier ved at tillade direkte visualisering af disse i vævssnit. Det giver en ideel platform for behandlingen (FFPE) vævsprøver, og kan let vedtaget af diagnostiske patologi laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Delvist understøttet af NIH tilskud (R43/44CA122444) og DOD BRCP tilskud (W81XWH-06-1-0682) til YL.
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||