JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Published: May 13, 2014
doi:
10.3791/51420
, , , , ,
1Centre for Gene Regulation and Expression, College of Life Sciences,University of Dundee, UK

Summary

Wir beschreiben eine Technik zur Analyse der globalen RNA-Synthese in Hypoxie mit bildgebenden. Click-Chemie Markierung von RNA wurde bisher nicht unter Hypoxie durchgeführt und ermöglicht die Visualisierung der globalen RNA Veränderungen auf Einzelzellebene. Dieser Ansatz ergänzt die bestehenden gemittelt RNA-Techniken, die eine direkte Visualisierung von Zell-zu-Zell-Veränderungen in der globalen RNA-Synthese.

Abstract

Hypoxie oder Absenken der Sauerstoffverfügbarkeit in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Auf der molekularen Ebene, Zellen initiieren einen bestimmten Transkriptionsprogramm, um eine angemessene und koordinierte zelluläre Antwort zu montieren. Die Zelle besitzt mehrere Sauerstoffsensor Enzyme, die molekularen Sauerstoff als Co-Faktor für ihre Tätigkeit benötigen. Diese reichen von Prolyl-Hydroxylasen zu Histondemethylasen. Die meisten Studien analysiert zellulären Reaktionen auf Hypoxie auf Zellpopulationen und durchschnittlich Studien, und als solche Einzelzellanalyse von hypoxischen Zellen nur selten durchgeführt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Analyse des globalen RNA-Synthese an Einzelzellebene in Hypoxie durch Verwendung Click-iT RNA Imaging-Kits in einer Sauerstoff gesteuert Arbeitsplatz, gefolgt von mikroskopische Analyse und Quantifizierung. Verwendung von Krebszellen gegen Hypoxie für unterschiedlich lange ausgesetzt wird RNA in jeder Zelle markiert und gemessen. Diese Analyse ermöglichtDie Visualisierung der zeitlichen und Zelle-zu-Zelle Veränderungen der globalen RNA-Synthese nach hypoxischen Stress.

Introduction

Hypoxie (niedriger Sauerstoffspannungen) tritt auf, wenn die normale Sauerstoffversorgung eines Gewebes ist gestört. Umwelt Sauerstoff ist sowohl ein Nährstoff-und ein Signalmolekül, die wichtige Hinweise für viele Zelltypen. Änderungen der Umgebungssauerstoff durch eine Gruppe von Dioxygenasen, die die Aktivität eines essentiellen Transkriptionsfaktor-Familie wie die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) bekannten Steuer erfaßt. Die HIFs aus zwei Untereinheiten, α und β besteht. Es gibt drei bekannte Isoformen von HIF-α (1, 2, 3) und mehrere Spleißvarianten von HIF-1β. HIF-1β konstitutiv exprimiert wird und nicht durch Umgebungssauerstoffgehalt 1 geregelt. Die HIF-α Familienmitglieder werden dynamisch durch eine Klasse von Prolyl-Hydroxylasen (PHDs) geregelt und die Hemmung von HIF-Faktor (FIH); die beide von Sauerstoff als Co-Faktor, um die Hydroxylierung von HIF-α 2,3 katalysieren. In Normoxie die HIF-α Familienmitglieder hydroxyliert und proteosom getaggtal-Abbaus durch die E3-Ligase, von Hippel Lindau (VHL). In Hypoxie die PHDs und FIH sind inaktiv oder haben eine verminderte Aktivität. Die HIF-α-Isoformen stabilisiert, bilden ein Heterodimer mit HIF-1β, und bewirken die Transkription von Genen, die die zelluläre Antwort auf die hypoxische Umgebung (1A) bereitzustellen 4.

Gegenwärtige Techniken für die RNA-Analyse konzentrieren sich auf die Quantifizierung der gemittelten Werte in einer gegebenen Zellpopulation. Zellen auf einer hypoxischen Stimulus durch Initiieren der Transkription einer Vielzahl von Genen, die sie zu ihrer feindlichen Umgebung 5 anpassen kann. Allerdings besteht häufig Hypoxie als Gradient und Zellen in einer hypoxischen Umgebung sind nicht Gegenstand einer einheitlichen hypoxischen Reiz. Wir beschreiben eine Implementierung der Click-iT RNA Imaging-Kits in einer Sauerstoff gesteuert Workstation zur globalen RNA-Synthese an Einzelzellebene in Hypoxie zu untersuchen.

Die RNA-Imaging-Kit verwendet eine einlkyne-modifizierten Nukleosid-, 5-Ethinyl Uridin (EU) und chemoselektiven Ligation, um den Nachweis der globalen RNA-Synthese zeitlich und räumlich in Zellen und Geweben 6 zu ermöglichen. Kurz gesagt werden Zellen mit Hypoxie und in Gegenwart von EU kultiviert behandelt. Sie werden dann fixiert und permeabilisiert und die EU-Eingliederung in entstehenden RNA wird durch chemoselektiven Ligation der EU mit einem Azid enthaltenden Farbstoff nachgewiesen. Ein typischer Arbeitsablauf für diese Reaktion ist in 1B gezeigt. Wir nutzten die RNA-Bildgebung Kit RNA-Synthese an Einzelzellebene, die von einer Behandlung mit Hypoxie führte zu untersuchen.

Die geringe Größe des Alkins Tag ermöglicht einen effizienten Einbau der modifizierten Nukleosid in RNA spezifisch. Die chemoselektiven Ligation oder "Klick"-Reaktion ist hoch effizient, schnell und spezifisch 10.07. Alle Reaktionskomponenten sind bioinert und die Reaktion erfordert keine extremen Temperaturen oder Lösungsmittel. Die Klick-Reaktion negiertdas Erfordernis für herkömmliche radioaktive Markierung und eine direkte Visualisierung der Ergebnisse, da der Ausgang ist Licht. Darüber hinaus kann die Nachweismolekül leicht eindringen komplexen Proben Berücksichtigung Multiplexanalyse mit Antikörpern zum Nachweis von RNA-interaktiven Proteinen. Diese RNA-Bildgebung Test ist mit organischen Farbstoffen einschließlich Alexa Fluor und Fluorescein (FITC) kompatibel.

Wir messen die Veränderung der RNA-Synthese nach der Behandlung der Zellen mit einer Umsetzung der offenen Mikroskopie-Umgebung für Remote-Objekte (OMERO). OMERO ist Open-Source-Software, verfügbar unter http://openmicroscopy.org/ . Dieses Mikroskop Bildvisualisierung und Analyse-Software ermöglicht den Zugriff auf und die Verwendung von einer Vielzahl von biologischen Daten, einschließlich der Verwaltung von mehrdimensionalen, heterogenen Datensätzen. Die Client-Anwendung ermöglicht Remote-Visualisierung und Analyse komplexer biologischer Bilddaten 11;wir haben es genutzt, um die visuellen Veränderungen in der globalen und Einzelzelle RNA-Synthese zu quantifizieren. Diese Daten und die erforderlich ist, um unsere RNA Imaging Experiment analysieren Schritte mit dieser Mikroskopbild Visualisierungs-und Analyse-Software finden Sie weiter unten.

Wir sahen uns an Veränderungen in der globalen RNA-Synthese nach der Behandlung menschlicher Osteosarkom (U2OS-Zellen) mit Hypoxie für bis zu 24 Stunden. Bei allen Bedingungen, die wir erfasst Zelle zu Zelle Änderung in der Ebene der RNA-Produktion. Kurze Zeiten von Hypoxie Exposition führte zu keinen signifikanten Änderungen in der Höhe der entstehenden RNA in den Zellen führen. Belichtung und 24 Stunden Hypoxie führte jedoch zu einem signifikanten Anstieg der Menge an RNA, die in Zellen produziert. Die meisten der zellulären Reaktionen auf Hypoxie nach längeren Belichtungsperioden, wie 4 bis 24 Stunden gemessen. Allerdings sind einige Mechanismen, die viel früher gelegt, zum Beispiel; NF-kappaB Aktivierung erfolgt innerhalb von 5-15 min der Hypoxie Exposition 12. Untersuchung kürzere hypoxia Belichtungszeiten ist daher gerechtfertigt und könnte von komplizierter Reaktionen wie Zellzyklus und Apoptose ablenken.

Protocol

1. Zellkultur und Behandlung Sammeln Sie die Reagenzien und Geräte in Tabelle 1 zu Kultur menschliche Osteosarkom (U2OS-Zellen) aufgeführt. Bereiten Sie alle Reagenzien und führen alle Gewebekulturtechniken in der Laminar-Air-Flow-Haube, um die Sterilität zu gewährleisten Vorbereitung des Kulturmediums, wie folgt: In 50 ml FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml Penicillin / Streptomycin auf das DMEM, um Endkonzentrationen von 10% (FCS) zu erreichen, 2 mM (L-Glutamin), 50 U / ml ( Penicillin) und 50 U / ml (Streptomycin). Warm das Kulturmedium bei 37 ° C in einem Wasserbad. Bereiten Sie die Zellen für die Behandlung: Sterilisieren mehrere Deckgläser in 70% Ethanol, an der Luft trocknen und legen Sie ein auf dem Boden der sechs 3,5 cm-Platten. Tauchen Sie die Deckgläser in 2 ml erwärmt kompletten DMEM (37 ° C), nach unten drücken mit den Deck Pinzette, um sicherzustellen, dass sie auf den Boden der Wells haften bleiben. Lösen Sie die U2OS Zellen aus ihrem Gewebe KultAbbildung Platte durch einmaliges Waschen mit 3 ml PBS, 4 ml Aufbringen erwärmt 0,05% Trypsin-EDTA (1%) und Inkubation bei 37 ° C für 7 min. Die Zellen in 6 ml DMEM komplett erwärmt, um das Trypsin-EDTA zu inaktivieren und rechnen mit einer Zählkammer. Plate 2 x 10 5 Zellen zu jedem der 3,5 cm-Platten in Punkt 1.3.1 vorbereitet. Schütteln Sie die Platte, um eine noch Zellverteilung zu gewährleisten. Damit sich die Zellen vor der Behandlung über Nacht anhaften. Behandeln Sie die Zellen, indem vier 3,5-cm-Platten in die Hypoxie-Workstation und lassen Sie die anderen zwei 3,5-cm-Platten im Brutschrank bei 37 ° C in normalen Sauerstoffbedingungen. Seien Sie bereit, um die RNA-Assay Kennzeichnung unter Bedingungen behandelt (in der Hypoxie-Kammer für die Hypoxie-behandelten Zellen) 1 h beginnen, bevor der Hypoxie Behandlung endet. Expose Zellen auf Hypoxie für 1 h 15 min, 1 h 30 min, 2 h und 24 h. Diese Zeitpunkte sind flexibel und benutzer bestimmt. Verwenden Sie eine normoxic 3,5 cm-Platte als positive Kontrolle und einer normoxischen 3,5 cm-Platte mit Actinomycin D (10 ug / ml Endkonzentration) für 4 Stunden als Negativkontrolle behandelt. Actinomycin D ist ein Inhibitor der globalen RNA-Synthese. Hinweise: Hoechst 33342 ist ein bekanntes Mutagen. DMSO ist bekannt, dass das Eindringen von organischen Molekülen in das Gewebe zu erleichtern. NaOH ist ätzend. HCl ist ätzend. Para ist sehr giftig für alle Tiere und können zum Tod beim Menschen verursachen. Triton X-100 kann zu Hautreizungen führen durch direkten Kontakt. Actinomycin D ist, wenn sie in Kontakt mit Haut oder Verschlucken giftig. Ergreifen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen, wenn alle gefährlichen Chemikalien. 2. Click-iT Assay Sammeln Sie die folgenden Reagenzien, die zusätzlich zu dem Click-iT-Assay-Kit erforderlich sind: Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) pH 7,2 bis 7,6, 3,7% Paraformaldehyd (PFA) in PBS, 1% Triton X-100 In PBS, entionisiertem Wasser (dH 2 O), Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 M Natriumhydroxid (NaOH) und 37% ige Salzsäure (HCl); Optional – pH-Indikator-Streifen. Eine frische PFA-Stammlösung, bevor das Click-iT Reaktion wie folgt: Setz 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O und 10 ul von10 M NaOH in 50 ml Falcon-Röhrchen. Kochen Sie 300 bis 400 ml H 2 O in einem großen Becher in der Mikrowelle, ein Wasserbad herstellen und diese in einer Abzugshaube. Legen Sie die 50 ml Falcon in das Wasserbad und vorsichtig rühren für 10 min, in regelmäßigen Abständen die Freigabe der Deckel, bis das PFA gelöst hat. Spritze die PFA-Lösung über einen 0,2 um Filter in einen anderen 50 ml-Falcon-Röhrchen, was zu einer 37% igen Lösung. Diese verdünnte durch Zugabe von PBS 10x und den pH-Wert auf 6,8 zu bringen durch Zugabe von 12 ul konzentrierter HCl. Option: Bestätigen Sie den richtigen pH-Indikatorstreifen mit den in der Abzugshaube. Verwenden Sie sofort oder zu speichern overnight bei 4 ° C. Bereiten Sie die Stammlösungen der RNA-Imaging-Kit wie folgt: In 373 ul dH 2 O auf die Komponente A, was zu einer Stammlösung von 100 mM der EU. Bei -20 ° C für bis zu einem Monat. In 85 ul DMSO zu Komponente B (Alexa Fluor 594) und mischen durch Pipettieren oder Vortexen. Bewahren Sie sowohl bei -20 ° C bis zu einem Jahr. 2 ml dH 2 O, um die Komponente E um einen 10X Lösung der RNA-Imaging-Kit Reaktionspuffer Additiv erstellen. Lagerung bei -20 ° C für bis zu einem Jahr, zu verwerfen, wenn Lösung entwickelt eine braune Farbe. Markierung von Zellen mit der EU: Bereiten Sie eine Lösung von 2X Arbeits EU von der 100 mM Lager in Schritt 2.3 in vorgewärmten Vollmedium (37 ° C) zubereitet Führen Sie den Rest dieses Schritt und Schritt 2.5 in der Hypoxie-Kammer für Zellen mit Hypoxie behandelt. . auf 1X Verdünnen durch Zugabe eines gleichen Volumens von 2X Arbeitslösung in den Medien containing Zellen. Inkubation für 1 h unter Behandlung Zellkulturbedingungen. Handy Fixation: Waschen Sie jede Vertiefung einmal mit PBS und 1 ml der 3,7% PFA Lager in Schritt 2.2 unter der Behandlung Bedingungen hergestellt. Inkubation: 15 min unter Behandlungsbedingungen. Die mit Hypoxie behandelten Proben kann von der Hypoxie Kammer an dieser Stelle entfernt werden. Entfernen Sie das Fixiermittel und Waschvorgang noch einmal mit PBS (Achten Sie darauf, von PFA entsorgen Abfall verantwortungs). Führen Sie die nächsten Schritte bei Raumtemperatur. Permeabilisierungs: Entfernen der Waschlösung und 1 ml 1% Triton X-100 in PBS in jede Vertiefung. Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer-und Waschvorgang noch einmal mit PBS. Markierten RNA-Detektion: Eine frische 1X Arbeitslösung von RNA-Imaging-Kit Reaktionspuffer Additiv durch Verdünnen der 10X-Lösung (in Schritt 2.3 vorbereitet) 1:10 in dH 2 O. Bereiten Sie die Imaging-RNA KitReaktion Cocktail nach Tabelle 2 für den Einsatz unmittelbar nach der Herstellung. Entfernen Sie die Waschlösung und fügen Sie 500 ul der RNA-Imaging-Kit Reaktion Cocktail zu jeder Probe. Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht schützen. Entfernen Sie die Imaging-RNA Kit Reaktionscocktail und einmal mit 1 ml RNA-Imaging-Kit Reaktionsspülung Puffer (Komponente F) waschen, entfernen Sie dann die RNA-Imaging-Kit Reaktionsspülung Puffer. Optional Multiplex-Reaktion: Führen Sie die zusätzlichen Antikörpermarkierung der Proben an dieser Stelle nach den Empfehlungen des Herstellers. DNA-Färbung: Wash Proben mit PBS entfernen Sie dann die Waschlösung. Verdünnen Sie die Hoechst 33342 (Komponente G) 1:1000 in PBS. 1 ml der verdünnten Hoechst 33342 in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur, vor Licht schützen. Entfernen Sie die Hoechst 33342-Lösung und waschen die Zellen zweimal mit PBS. Entfernen Sie den Wasch solution und fahren Sie mit der Lichtmikroskopie. 3. Lichtmikroskopie Berg Deckgläser: Platz 10 ul Montagemedium auf der Mitte einer Standardobjektträger. Legen Sie das Deckglas mit der Zellseite nach unten auf der Mitte des Objektträgers, um den aliquoten Eindeckmedium abzudecken. Achten Sie auf die Erzeugung von Blasen in der Montagemedium zu vermeiden, da dies die nachfolgende Bild Erwerb verschleiern. Kleben Sie das Deckglas auf dem Objektträger durch die Anwendung klaren Nagellack auf ihren Umfang. Lassen Sie für 5 min bei Raumtemperatur trocknen. Vor Licht schützen. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden folgende Montage. Bildaufnahme: Erfassung von Bildern mit einem Weitfeldmikroskop in der Lage, Fluoreszenz-Detektion. Ungefähre Fluoreszenz / Anregungsemissionsmaxima für die Alexa Fluor-Farbstoff Hoechst 33342 an DNA gebunden sind in Tabelle 3 gezeigt. Perform Imaging mit einem 40X/1.30 NA Ölimmersion und die Aufnahmen mit einer gekühlten CCD-Kamera. 4. Datenanalyse Entfalten, Bilder mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialien Tabelle) vor dem Import in die OMERO-Client. Normalisieren Rendering-Einstellungen für alle Bilder im gleichen Experiment im Mikroskopbild Visualisierungs-und Analyse-Software, indem die Rendering-Einstellungen von Steuer normoxischen Zellen zu allen anderen Bedingungen. Verwenden Sie die Region of Interest (ROI)-Werkzeug in der Mikroskopbild Visualisierungs-und Analyse-Software (siehe Materialien Tabelle), um Kerne von jedem Bild zu wählen. Erhalten mittleren Intensitäten für jedes ROI und der Mittelwert und Standardabweichung für jeden Zustand, der durch die Wahl der Option Intensitätsanalyse, einschließlich einer Zahl zwischen 30 bis 50 Zellen. Construct Streudiagramme mit Hilfe eines Daten Grafik-Software (siehe Materialien Tabelle) durch Auftragen alle einzelnen Mittelintensitätswerte in Schritt 4,2 t erhalteno reflektieren Variabilität zwischen den Zellen unter jeder Bedingung. Alternativ bauen Balken, den Mittelwert plus Standardabweichung Intensität der entstehenden RNA darstellen.

Representative Results

Ein Schema des RNA Belichtungskit Reaktion wird in 1B gezeigt. Wir haben diese Reaktion zur quantitativen Bestimmung der Gesamt-RNA-Synthese in U2OS-Zellen nach der Behandlung mit Hypoxie sowohl auf individueller (Einzelzelle) und globaler Ebene (Population von Zellen). Die Zellen wurden mit Hypoxie und in Gegenwart von EU kultiviert behandelt. Sie wurden dann fixiert und permeabilisiert und EU-Einbau wurde von chemoselektiven Ligation der EU mit einem Azid enthaltenden Farbstoff nachgewiesen. Dieser "Klick"-Reaktion führt zu einer Fluoreszenzemission, die detektiert und quantifiziert unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie ist. Fig. 2A zeigt ein typisches Ergebnis dieses Experiments. Fluoreszenzmarkierten Zellen werden rot pseudocolored und das Bild in der offenen Mikroskopie-Umgebung für Remote-Objekte (OMERO) eröffnet worden. Dieses Mikroskop Bild Visualisierung und Analyse-Software verfügt über einen eingebauten ROI-Tool, das verwendet werden kann, um einzelne subzellulärer Strukturen auszuwählenturen und quantitativ zu analysieren Bildintensität innerhalb der gewählten Region. Ein typisches Beispiel für die Datenausgabe nach der Anwendung dieses Werkzeugs in dem Client-Programm kann in Fig. 2B gesehen werden kann; Einzelzelle Intensitäten werden neben einem repräsentativen Bild aus dem Experiment, die als Sichtprüfung, um die Gültigkeit der Daten sicherzustellen, dient gezeigt. Die einzelnen Zellfluoreszenzintensitäten können als Streudiagramm, um die Verteilung der einzelnen Zellintensitäten innerhalb des behandelten Zellpopulation zeigen aufgetragen werden. Ein Beispiel dieser Art von Diagramm ist in Fig. 2C zu sehen. Plotten Intensitätsdaten auf diese Weise ist nützlich, da es einen schnellen Vergleich der Behandlungsergebnisse und zeigt deutlich die signifikante Heterogenität innerhalb einer Behandlungszellpopulation, die sonst mit Standard-Datendarstellung verdeckt wird. Die Antwort Heterogenität ist interessant, in diesem Experiment, denn obwohl eine einheitliche hypoxischen Stimulus war einzu den Zellen ngewandte, ist es offensichtlich, dass jede Zelle von der gleichen Monoschicht Population unterschiedlich auf diese Anregung reagiert. 2D zeigt das Gesamtergebnis aus unserem Experiment. Fluoreszenzintensitäten von allen Zellen innerhalb einer Population Behandlung wurden gemittelt und dann in diesem Balkendiagramm dargestellt. Ein Student-t-Test wurde verwendet, um die statistische Wahrscheinlichkeit von jeder Behandlungsgruppe wesentlich von der Steuerung zu berechnen. Interessanterweise zeigen diese Daten, dass es einen statistisch signifikanten Anstieg der globalen RNA-Synthese über die Zeit, wenn U2OS-Zellen mit Hypoxie behandelt (manchmal mehr als 1 h 30 min * p <0,01;. ** P <0,05 und *** p <0,001 und n> 30). Diese Daten zeigen, dass nach längerer Hypoxie-Behandlung, die Zelle selbst in dieser feindlichen hypoxischen Umgebung konzentriert seine Anstrengungen auf die Produktion von RNA. Actinomycin D-Behandlung komplett abträgt die Fluoreszenzintensität wie erwartet. 1. A. Die HIF-System reagiert auf Veränderungen der zellulären Sauerstoff. In diesem vereinfachten schematische Hypoxie stabilisiert sich die HIF-Heterodimer durch die Verhinderung HIF-α-Hydroxylierung (-OH) durch die Prolylhydroxylase Enzyme (PHDs) und ihrer späteren polyubquitination von von-Hippel-Lindau-Protein (VHL). HIF Stabilisierung Ergebnisse bei der Aktivierung von Genen, die die unzähligen Zelle reagieren auf zellulärer Hypoxie B. RNA-Synthese kann mit dem Click-IT-Test nachgewiesen werden helfen. Zellen werden mit EU nach der Behandlung das Click-Reaktion erkennt die RNA-Synthese, die durch Fluoreszenzintensität und Lichtmikroskopie quantifiziert werden können, gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere vers ansehenIonen dieser Figur. Abbildung 2. A. Screenshot aus OMERO typische mikroskopische Ausgangs folgenden RNA-Markierung zeigen. Dieses Mikroskop Bildvisualisierung und Analyse-Software können schnell extrahieren Intensitätsdaten auf Einzelzellebene mit seiner eingebauten ROI Makro. Ein Screenshot der Ausgabe dieses Befehls wird in B. Globale RNA-Synthese gezeigt, kann von einzelnen Zell Intensität zu entnehmen ist, kann der Bereich der in dem Streudiagramm zu sehen ist C. Eine formale Darstellung dieser aggregierten Daten ist zu erkennen, D. * p <0,01; ** P <0,05 und *** p <0,001 und n> 30. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <tablE border = "0" cellpadding = "0" cellspacing = "0"> Zellkultur-Reagenzien Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), pH 7,2 bis 7,6 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) Fötalem Kälberserum (FCS)-Filter sterilisiert Penicillin / Streptomycin L-Glutamin 0,05% Trypsin-EDTA (1%) 70% Ethanol Actinomycin D (1 ug / ul Lager) Zellkultur-Ausrüstung Sterile Pasteurpipetten Eine Reihe von Zellkultur-behandelten Plast zur Pflege und Behandlung von Zellen in Kultur Wasserbad bei 37 ° C eingestellt Laminar-Flow-Haube Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 Hypoxie Workstation bei 37 ° C, 5% CO 2, 1% O 2 Deckgläschen Präzisions-Pinzette Hämozytometers Tabelle 1. Chemikalien und Geräte für die Kultivierung von Zellen U2OS erforderlich. Reaktionskomponenten Anzahl der Deckgläser 1 2 4 5 6 10 Click-iT RNA-Reaktionspuffer (Komponente C) 428 ul 856 ul 1,7 ml 2,1 ml 2,58 ml 4,3 ml CuSO 4 (Komponente D) 20 ul 40 ul 80 ul 100 ul 120 ul 200 ul Alexa Fluor Azid (in Schritt 2.3 vorbereitet) 1,8 ul 3,7 ul 7,4 ul 9.3 ul 11.28 ul 18,8 ul Click-iT Reaktionspuffer Additiv (in Schritt 2.3 vorbereitet) 50 ul 100 ul 200 ul 250 ul 300 ul 500 ul Ungefähre Gesamt Volume 500 ul 1 ml 2 ml 2,5 ml 1,5 ml 5 ml . Tabelle 2 RNA Imaging Kit Reaktion Cocktails: Referenz-Tabelle mit Verhältnis von Master-Mix-Komponenten für die RNA-Imaging-Kit-Reaktion nach der Anzahl der Deckgläser zu gefärbt werden. Fluorophor Anregung (nm) Emission (nm) Alexa Fluor 488 495 519 Hoechst 33342, an DNA gebunden 350 461 . Tabelle 3 Fluoreszenz / Anregung Emissionsmaxima: Etwa Fluoreszenz / Anregung Emission maximal für Alexa Fluor Farbstoff und Hoechst 33342 an DNA gebunden.

Discussion

Wir haben unser Verwendung eines RNA-Sichtbarmachungsausrüstung, um die Effekte der Hypoxie auf die RNA-Synthese in Osteosarkom (U2OS-Zellen) beschrieben untersuchen. Diese Technik ist relativ einfach und liefert Daten über die globale Transkriptions auf Einzelzellebene. Wir modifizierten die herkömmlichen Protokoll für dieses Kit, um die Kennzeichnung in einer Hypoxie Kammer zu integrieren. Nach unserer Kenntnis ist dies der erste Bericht über die Verwendung dieser Technik, um Änderungen in der RNA-Synthese in Hypoxie zu messen. Die RNA Belichtungskit wir verwendeten, ist geeignet für Experimente in Hypoxie, da es keine radioaktiven Isotope erfordert und technisch kompatibel mit den Einschränkungen, die in einer kontrollierten Atmosphäre Workstation. Häufige Probleme mit dieser Technik Sorge effiziente Fixierung und Kennzeichnung der Probe. Es ist äußerst wichtig, dass die PFA für die Festsetzung des Proben ist frisch und die Waschschritte, die das "Klick"-Reaktion folgen, werden als gering beschrieben, um die Hintergrundfärbung der Probe zu gewährleisten durchgeführt. Wenn bintergrund Fluoreszenz wird zu einem Problem, wird empfohlen, mit 1 ml RNA Belichtungskit Reaktionsspülung Puffer nach dem Schritt 2.7.4 einmal zu waschen.

Die hier genannten RNA-Imaging-Kit stellt einen bedeutenden Fortschritt in der RNA-Imaging-Technologie in Bezug auf die Benutzerfreundlichkeit und die Spezifität und die Geschwindigkeit der Reaktion. Diese Technik wird hauptsächlich durch die Zeit, die für die Probe kenn beschränkt. Die RNA-Imaging-Kit erfordert eine Kennzeichnung 1 Stunde Zeit, dass die Prüfung der schnellen Veränderungen in der globalen RNA, die normalerweise in diesem Zeitraum auftreten würde, verhindert. Es ist aus diesem Grund unsere ersten Zeitpunkt auf 1 Stunde und 15 Minuten beschränkt. Die Technik ist mit einigen anderen Einschränkungen, die weitgehend betreffen Kompatibilität mit anderen fluoreszierenden Markern Reagens, zum Beispiel, ist diese RNA Abbildungssatz nicht kompatibel mit Phalloidin-Färbung verbunden.

Alle bestehenden Ansätze des Studiums RNA-Synthese in Zellen auf Einbau von modifizierten Nucleoside in der Basisnaszierende RNA und die Detektion von Etiketten integriert mit anderen Mitteln. Die bahnbrechenden Ansatz zur Verwendung von radioaktiv markierten RNA-Vorstufen gefolgt von der Detektion mit Autoradiographie basiert. Diese Methode führte zu einer Entdeckung von Zellzyklus-Stadien und andere wichtige Erkenntnisse; aber es hat eine Menge Nachteile, wie die Schwerfälligkeit der Radioaktivität Arbeit, lange Belichtungszeiten und Bilder mit niedriger Auflösung von 6 Autoradiographie. Der nächste Vorteil auf dem Gebiet ausgenutzt mittels Immun die Notwendigkeit der Radioaktivität zu entfernen. RNA wurde durch Einbau von BrU gefolgt von Immun Nachweis markiert. Jedoch effiziente Antikörperbindung erforderlich Nukleinsäure Denaturierung, um Zugang zu DNA oder RNA, die den Verlust der Zellmorphologie hervorgerufen und beschädigt die Epitope von vielen Proteinen, die Verhinderung der weiteren Detektion mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern 13 zu verbessern. Die Einführung von "Klick-Chemie"-Technologie vereinfacht die Erkennung und Schritt ter Verfahren im Vergleich zu Autoradiographie und Immunchemie. Die Technologie basiert auf Azid-Alkin Huisgen-Cycloaddition in dem terminalen Alkin 5-ethyniluridine bindet mit Azid mit dem Fluorophor in Anwesenheit von Cu (I) konjugiert basiert. Die Reaktion ist spezifisch, schnell, keine zusätzlichen Schritte erfordern und ist mit immunchemischen Nachweis von anderen Zellbestandteile leicht kompatibel.

Unter Verwendung dieser RNA-Imaging-Technologie haben wir gezeigt, dass Zellen in der gleichen Mono Bevölkerung, verschiedene RNA-Syntheserate in Reaktion auf Hypoxie. Wir beschränken unser Experiment, um die Wirkung von nur RNA-Produktion zu untersuchen; es ist jedoch ganz mit dieser RNA Belichtungskit möglich, modifizierte, zusätzliche Multiplex-Reaktionen, die für eine komplexe Analyse der RNA-Produktion erlauben zuführen. Beispielsweise sekundäre Färbung mit einem spezifischen Marker für aktive Transkription wie Ebenen phosphorylierten RNA-Polymerase II oder Komponenten des Translations Antikörpertion Maschinen, um eine Anzeige der Menge des neu erzeugten RNA in ein Protein umgewandelt wird geben sind möglich. Zusätzliche Proteine ​​wie Actin, einem Protein, das nicht wesentlich mit Hypoxie ändern sollte, könnte als zusätzliche Kontrolle getestet werden. Ferner könnten verschiedene Zelltypen getestet werden, da es sehr wahrscheinlich ist, dass unterschiedliche Zellen unterschiedliche RNA-Syntheseraten und sogar verschiedene Reaktionen auf Hypoxie.

Verwendung dieser RNA Belichtungskit ist ganz einfach die Schritte vorgesehen sind, wie beschrieben, durchgeführt. Kritische Schritte im Protokoll beinhalten Zelle Beschichtung, Zell Fixierung und Färbung und Bildaufnahme. Es ist wichtig, um die Zellen in der beschriebenen Dichte Platte bei Experimenten an Über-oder Unterfluss zu verhindern, welche das Ergebnis wesentlich beeinflussen. Es ist auch wichtig, um frisches Fixiermittel zu verwenden, die die bestmögliche "Momentaufnahme" der Zelle genommen und dafür Sorge zu tragen, wenn Waschen der Zellen nach Färbung, die bac reduzierenkground auf ein Niveau, das für eine effiziente Analyse akzeptabel ist. Schließlich ist das Verfahren zur Bildaufnahme von entscheidender Bedeutung, um Bilder, die von einer Qualität gut genug für eine nachfolgende Analyse zu erzielen. Wir empfehlen die Verwendung der besten Lichtmikroskop zur Verfügung, um Proben optisch wie dem Mikroskop in diesem Protokoll, das in den meisten forschungsintensiven Zentren weltweit ist verwendet zu untersuchen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JB ist ein CRUK klinischen Kollegen, AS ist ein Wellcome Trust Doktorand, der SR-Labor wird von einem Senior Research Fellowship CRUK (C99667/A12918) finanziert. Diese Arbeit wurde von zwei Wellcome Trust Strategische Awards (097945/B/11/Z und 095931/Z/11/Z) unterstützt.

Materials

U-2 OS Primary Cells European Collection of Cell Cultures 92022711 http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true
PBS Gibco 14190094 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094
DMEM Gibco 41966029 https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029
FCS Gibco 10270106 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106
Penicillin/Streptomycin Lonza DE17-603E http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx
L-Glutamine Lonza BE17-605E http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx
0.05% Trypsin-EDTA (1%) Gibco 25300062 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062
Hypoxia Chamber Ruskinn InVivo2 300 http://www.ruskinn.com/products/invivo2300
Click-iT assay Kit Invitrogen C-10329/C10330 http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D
pFA Sigma 76240 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&region=GB
Triton X-100 Sigma X-100 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&region=GB
10M NaOH Sigma 72068 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&region=GB
37% HCl VWR 20252.335 https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or
VectaShield Mounting Medium Vector Laboratories H-1400 http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483
Actinomycin D Sigma A9415 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&region=GB
Deltavision Core Microscope Applied Precision N/A http://www.appliedprecision.com/
softWoRx [Refered to in text as image processing software] Applied Precision N/A http://www.api.com/softworx.asp
CoolSnap HQ2 CCD Camera Photometrics N/A http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] OME N/A http://openmicroscopy.org/
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] Systat Software Inc. N/A http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
  2. Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
  3. Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
  4. Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
  5. Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
  6. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
  7. Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
  8. Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
  9. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  10. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  11. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
  12. Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
  13. Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on “click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).

Tags

Single Cell AnalysisRNA SynthesisHypoxiaOxygen SensingTranscriptional ResponseCancer CellsMicroscopy AnalysisClick-iT RNA Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Biddlestone, J., Druker, J., Shmakova, A., Ferguson, G., Swedlow, J. R., Rocha, S. Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia. J. Vis. Exp. (87), e51420, doi:10.3791/51420 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image