Ratón Rombencéfalo<em> Ex Vivo</em> Cultura para el Estudio de la Migración facial Branchiomotor Neurona

1. Opcional: Preparar Beads Heparina Affi-gel (perlas de gel) para FBM Ensayo de atracción NOTA: preparar perlas de gel de al menos 1 día antes de comenzar el procedimiento de explante. Lavar 100 l de gel de heparina suspensión de perlas con PBS estéril durante 20 min en un rodillo a temperatura ambiente (RT). Perlas de pellets en una centrífuga de mesa durante 5 minutos a 13.000 x g. Añadir PBS estéril y repetir el proceso de lavado de 4x. Después del lavado final, quitar PBS y remojar los granos en un pequeño volumen de una solución estéril que contiene la proteína recombinante de elección, teniendo cuidado de cubrir las perlas con la solución. Este protocolo utiliza 100 ng / l VEGF165 humana recombinante en PBS para reproducir un experimento publicado previamente 16. Incubar las perlas de gel de heparina con la solución de proteína recombinante durante un mínimo de 12 horas y un máximo de 1 semana en un rodillo a 4 º C. 2. Revestimiento de la Cultura Insertars Explantes cerebro posterior se cultivan en la cultura Corning inserta con un tamaño de poro de 8 micras o inserciones equivalentes. Insertos de cultivo se pueden reutilizar después de la finalización del protocolo, siempre que se lavan con agua destilada, esterilizados con etanol, y se almacenan en etanol al 70% hasta que se necesite. NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo en una campana de flujo en condiciones estériles. Preparar los medios de cultivo de explante que consiste en medio Neurobasal suplementado con B27 (20 l / ml), glucosa (6 mg / ml) y penicilina / estreptomicina (5 mg / l). Cultura de lavado inserta con PBS estéril durante 5 min y seco durante 5-10 min bajo la campana de flujo. Coloque un inserto de cultivo en cada pocillo individual de una placa 12well. Nota: Las inserciones pueden necesitar un pequeño empujón para encajar perfectamente en el pozo. Cubrir los insertos de cultivo con 10-20 mg / ml de laminina de ratón en medio Neurobasal y colocarlos en una incubadora de cultivo de tejidos (37 º C, 5% de CO <sub> 2) durante 1 hora. Nota: revestimiento debe llevarse a cabo en el día de la explantación. 3. Disección de Hindbrains de E11.5 embriones de ratón Cull temporizado ratón hembra embarazada con un procedimiento éticamente aprobado el día embrionario (E) 11,5 y colocar el útero que contiene los embriones en un plato de plástico de 100 mm con medio L15 enfriado en hielo. NOTA: Todos los pasos de disección se deben realizar en L15 enfriado en hielo. Utilizando un microscopio de disección y Dumont relojero fórceps número 5, rasgar la pared muscular del útero para exponer los embriones, suelte cada embrión, cortar el cordón umbilical, y cuidadosamente quite el saco vitelino. Usando una pipeta Pasteur de plástico con una abertura de gran calibre, transferir cada embrión en una placa de plástico limpio con L15 enfriado en hielo. Con unas pinzas Dumont, decapitar al embrión justo por encima de las extremidades anteriores. Si el experimento requiere el genotipado de los embriones, recolectar muestras de tejido para el aislamiento del ADN genómico (por ejemplo, una pequeña piece del saco vitelino o punta de la cola 16,20). Gire la parte dorsal de la cabeza y de identificar el 4 º ventrículo, que está cubierto por una delgada capa de tejido (Figura 2B). Perforar con cuidado el roofplate y empezar a pelar lejos caudalmente a lo largo de la línea media sobre la parte posterior del cerebro posterior y la médula espinal, y el rostral sobre el cerebro medio. El cerebro posterior ahora debe ser expuesto (Figura 2C). Burlarse cuidadosamente lejos la mesénquima de la cabeza restante y cualquier meninges que se adjuntan a la parte pial de la parte posterior del cerebro (Figura 2D). Retire el tejido del cordón del cerebro medio y la médula para que el cerebro posterior se despliega y se acueste en una preparación a libro abierto (Figura 2E). El uso de un gran calibre Pasteur plástico pipeta, transferir cada cerebro posterior diseccionado a una placa de 12 pocillos que contiene helado L15 y guardarlos en hielo hasta que todos hindbrains se han disecado. El uso de un de gran calibre Pasteur plástico pipeta, transferir un pecadogle cerebro posterior a un plato vacío, manteniendo una preparación de libro abierto, cara ventricular hacia arriba, en una gota de aproximadamente 100 l L15. Transferencia de unos pocos microlitros de las perlas de gel de heparina incubadas a la misma gotita. Nota: Debido a que los tamaños de los granos son variables, es aconsejable transferir alrededor de 10 cuentas y luego elegir un tamaño óptimo para el trasplante en el cerebro posterior. Hacer un pequeño desgarro en el tejido de cerebro posterior y insertar cuidadosamente 1-3 perlas de gel en el tejido cerebro posterior en el nivel de R5 / 6, a mitad de camino entre la línea media y el borde lateral de la parte posterior del cerebro, disminución de los mismos en el tejido de modo que el talón se coloca justo debajo de la superficie posterior del cerebro. NOTA: El procedimiento de disección puede tardar entre 5-20 min / cerebro posterior, dependiendo de la experiencia, y puede prolongarse durante un período prolongado si camadas son grandes, en todo caso, hindbrains deben estar en la cultura de no más de 3 horas post-mortem para la buena resultados. 4. RombencéfaloExplante Cultura Retire la placa que contiene los insertos de cultivo de la incubadora, aspirar la solución de revestimiento laminina. Coloque un inserto de cultivo en una placa de cultivo separado lleno de helado L15 y, con un diámetro ancho Pasteur plástico pipeta, transferir cada lado ventral posterior del cerebro para arriba sobre la inserción del cultivo (Figura 2G). El cerebro posterior debe quedar completamente plana sobre la membrana de inserción. Levante con cuidado la inserción del cultivo de la antena y aplíquelo varias veces en un pañuelo de papel limpio para eliminar el exceso de líquido. Este proceso asegura que el cerebro posterior se adhiere a la inserción de la cultura en una preparación a libro abierto plana. Si el cerebro posterior se queja, su tejido puede irreversiblemente crecer juntos. Llene la placa de 12 pocillos original con 500 l de medios de cultivo precalentado y coloque el inserto de nuevo en este pozo. Ajustar cuidadosamente el volumen con otro 400-600 l de los medios de comunicación para cubrir sólo la parte posterior del cerebro, lo que garantiza que el cerebro posterior no flotafuera de la membrana. Si flota, vuelva al paso 4.4 y repetir hasta que la parte posterior del cerebro se mantiene unida a la membrana. En esta etapa, es posible añadir inhibidores biológicos de interés para los medios de comunicación para estudiar su efecto sobre la migración de las neuronas FBM. NOTA: Si va a implantar cuentas o administrar otros tratamientos, se recomienda mantener al menos 2 explantes de control bajo condiciones normales de crecimiento por experimento para asegurar que el experimento ha sido creado con éxito. Incubar explantes durante 24-30 horas en un incubador de cultivo de tejidos (37 º C, 5% de CO 2). 5. Wholemount Inmunofluorescencia tinción de Rombencéfalo explantes Aspirar los medios de comunicación de cada pocillo, enjuagar en PBS y fijar, por 2 horas a 4 ° C con agitación suave en frío de hielo 4% de formaldehído (recién preparada o recién descongelado 4% de paraformaldehído disuelto en PBS). Nota: No intente retirar cerebro posterior de la inserción del cultivo antes de la fijaciónes completa. Enjuague 3 veces con PBS. Retire con cuidado los hindbrains de los insertos de cultivo utilizando pinzas Dumont. Algunos explantes son difíciles de pelar, pero por lo general se pueden levantar aplicando presión suave a través de la expulsión repetida PBS de una pipeta. Transfiera los hindbrains a 2,0 ml tubos de fondo redondo para el etiquetado de inmunofluorescencia. Permeabilizar hindbrains durante 30 min a temperatura ambiente (TA) en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBT) con suave de rodillo. Incubar durante 1 hora a TA en PBT que contiene 10% de suero de cabra normal inactivado por calor con balanceo suave. Incubar explantes con balanceo suave a 4 ° C durante 5 días con el anticuerpo primario específico para ISL1, diluido 1:100 en PBT que contiene 1% de suero de cabra normal inactivado por calor. Lave los explantes a TA 4x con PBT durante 15 min cada uno. Incubar explantes con suave balanceo a temperatura ambiente durante 3 h con fluoróforo conjugado de cabra anti-ratón (por ejemplo, Alexa Fluor 488 cabra antiratón, diluido 1:200) en PBT que contiene 1% de suero de cabra normal inactivado por calor. Lave los explantes 4x a TA con PBT durante 15 min cada uno con suave balanceo. Postfix los explantes en formaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cubra una placa de vidrio con 3 capas de cinta aislante color negro y los impuestos especiales con un bisturí a una pequeña plaza de la cinta en capas para crear un bolsillo para los explantes, como alternativa, utilizar un portaobjetos de vidrio depresión. Monte cada cerebro posterior en el reactivo SlowFade en un bolsillo y cubrir con un cubreobjetos de vidrio, evitando cuidadosamente para atrapar burbujas de aire y la imagen usando un microscopio confocal de barrido láser. NOTA: Como alternativa a la inmunotinción, la hibridación in situ con ribosondas que reconocen FBMS (es decir ISL1 o PHOX2B) puede ser utilizado para visualizar las neuronas FBM 16,21. Resumen de los pasos y el calendario ~ 14 días: el apareamiento para obtener embarazos E11.25 temporizado Opcional: Bead preparación (PROTOCOLO DEl 1): ~ 2 horas, el día antes del aislamiento del embrión Preparar insertos de cultivo y medios de comunicación (Protocolo 2): ~ 30 min, antes del aislamiento del embrión Aislamiento de embriones y la disección posterior del cerebro (pasos 3.1 a 3.4): ~ 10 min / embriones Disección Rombencéfalo (pasos 3.5 a 3.7): ~ 5-10 min / rombencéfalo Procedimiento de explante (pasos 3.8 a 3.9): ~ 5-10 min / rombencéfalo Opcional: la implantación de bolas (pasos 3.10-3.11): ~ 5-10 min / rombencéfalo Cultura explante (paso 4.7): 24 horas Fijación para la tinción de anticuerpos (paso 5.1): 2 hr Procedimiento de tinción y de imagen (Protocolo 5): 5 días