마우스 후뇌<em> 전의 VIVO</em> 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

1. 선택 사항 : FBM 장르 분석을 위해 아피 – 겔 헤파린 구슬 (젤 구슬)를 준비 참고 : 이식편의 절차를 시작하기 전에 적어도 일일 젤 구슬을 준비합니다. 실온 (RT)에서 롤러에 20 분 동안 멸균 PBS 100 μL 젤 헤파린 구슬 서스펜션을 씻으십시오. 13,000 X g에서 5 분을위한 테이블 탑 원심 분리기의 펠렛의 구슬. 멸균 PBS를 추가하고 세척 절차 배를 반복합니다. 최종 세척 후 PBS를 제거하고 솔루션과 비즈를 충당하기 위해주의하면서 선택의 재조합 단백질을 포함하는 살균 용액의 작은 양의 구슬을 적신다. 이 프로토콜은 이전에 출판 된 실험 (16)을 재현하기 위해 PBS 100 μL / NG 재조합 인간 VEGF165를 사용합니다. 4 ℃에서 롤러에 12 시간의 최소 재조합 단백질 용액 1 주 최대 젤 헤파린 구슬을 품어 2. 문화 삽입의 코팅의 후뇌 외식 코닝의 문화를 배양 8 μm의 기공 크기, 또는 이에 상응하는 인서트로 삽입합니다. 농경 인서트들이, 증류수로 세척하고, 에탄올로 소독하고, 필요할 때까지 70 % 에탄올 중에 저장되어 제공되는, 프로토콜의 완료 후에 재사용 될 수있다. NOTE : 다음 단계는 무균 조건 하에서 흐름 후드에서 수행되어야한다. B27 (20 μL / ml)로 보충 Neurobasal 배지 이루어진 이식편 배양 배지를 준비, 글루코스 (10 ㎎ / ㎖), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (5 ㎍ / μL). 세척 문화는 5 분, 흐름 후드 아래에 5 ~ 10 분 동안 건조 멸균 PBS로 삽입합니다. 12well 플레이트의 각 우물에 하나의 문화 삽입물을 놓습니다. 참고 : 삽입 우물에 꽉 맞게 작은 푸시를해야 할 수도 있습니다. Neurobasal 배지에서 10 ~ 20 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌과 문화의 삽입을 커버하고 37 ° C, 5 % CO (조직 문화 인큐베이터에 배치 <sub> 2) 1 시간 동안. 참고 : 코팅 explanting의 날에 실시한다. 3. E11.5 마우스 배아에서 Hindbrains의 해부 배아 일에 윤리적 승인 절차 (E) 11.5 초과 임신 여성 마우스를 추려과 얼음처럼 차가운 L15 매체와 100mm 플라스틱 접시에 배아가 들어있는 자궁을 배치합니다. 참고 : 모든 해부 단계는 얼음처럼 차가운 L15에서 수행해야합니다. 해부 현미경을 사용하여 뒤몽 시계 제조는, 배아를 노출하는 자궁의 근육 벽을 찢어 각각의 배아를 분리 한 탯줄을 절단하고,주의 깊게 난황을 제거, 숫자 5를 핀셋. 넓은 구멍 구멍을 가진 플​​라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음처럼 차가운 L15 깨끗한 플라스틱 접시에 각각의 배아를 전송합니다. 뒤몽의 집게를 사용하여, 단지 앞다리 위의 배아 목을 벨. 실험은 배아의 유전자형을 필요로하는 경우, 게놈 DNA의 분리를위한 조직 샘플을 수집 (예 : 작은 조각 복장난황 또는 꼬리 끝 16, 20)의 전자. 최대 헤드 등의 측면을 켜고 얇은 조직 층 (그림 2B)이 적용됩니다 제 4 뇌실을 확인합니다. 조심스럽게 roofplate을 뚫고 후방 후뇌와 척수에 중간 선을 따라 꼬리 쪽을 벗겨하기 시작 rostrally 중뇌에. 후뇌는 지금 (그림 2C)를 노출해야합니다. 조심스럽게 남아있는 머리 중간 엽와 후뇌 (그림 2D)의 pial 측면에 부착 된 모든 수막을 멀리 애타게. 후뇌가 펼쳐진 있도록 중뇌와 척수 조직을 제거하고 책의 준비 (그림 2E)에 평평하게 거짓말을 할 수 있습니다. 넓은 구멍 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음처럼 차가운 L15를 포함하는 12 – 웰 플레이트에 각 해부 후뇌를 전송하고 모든 hindbrains 해부 될 때까지 얼음에 저장합니다. 넓은 구멍 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 죄를 전송그것을 대략 100 μL의 L15의 물방울 최대 책 준비, 심실 측면을 유지 빈 접시에 GLE의 후뇌. 같은 물방울을 배양 젤 헤파린 구슬 몇 마이크로 리터를 전송합니다. 참고 : 구슬의 크기가 변수이므로,이 약 10 구슬을 전송 한 후 후뇌에 이식을위한 최적의 크기를 선택하는 것이 좋습니다. 후뇌 조직에있는 작은 눈물을 조심스럽게 조직으로 그들을 낮추고, 중간 선 및 후뇌의 측면 가장자리 사이의 약 절반, [5 / 6의 수준에 후뇌 조직에 1-3 젤 구슬을 삽입되도록 구슬은 그냥 후뇌 표면 아래에 위치한다. 참고 : 해부 절차는 경험에 따라 5 ~ 20 분 / 후뇌 사이에 걸릴 수도, 그리고 새끼가 큰 경우 연장 된 기간 동안 늘릴 수 있으며, 어떤 경우에, hindbrains 좋은 3 시간의 사후보다 더 이상 문화에 있어야합니다 결과. 4. 후뇌이식편 문화 인큐베이터에서 배양 삽입을 포함하는 플레이트를 제거, 라미닌 코팅 솔루션을 대기음. 문화 삽입합니다 (그림 2G)에 각각 최대 후뇌 복부 측면을 전송, 넓은 구멍 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여, 얼음처럼 차가운 L15와 가득 별도의 배양 접시에 하나의 문화 삽입물을 놓습니다. 후뇌는 삽입 막에 완전히 평평해야합니다. 조심스럽게 접시에서 배양 삽입을 들어 올려 물기를 제거하는 깨끗한 조직 종이에 여러 번 줘봐. 이 프로세스는 후뇌 플랫, 책의 준비에 문화 삽입 규칙을 준수한다는 것을 보장한다. 후뇌가 곱슬 경우, 그 조직은 비가 역적으로 함께 성장 할 수 있습니다. 500 ㎕의 예비 가온 문화 매체를 원래의 12 – 웰 플레이트를 입력하고 잘에 다시 삽입을 배치합니다. 조심스럽게 후뇌가 뜨지 않는 것을 보장, 단지 후뇌를 커버하는 미디어의 또 다른 400 ~ 600 ㎕를 사용하여 볼륨을 조정막 끕니다. 이 수레 경우, 4.4 단계와 후뇌가 막에 붙어 남을 때까지 반복 돌아갑니다. 이 단계에서, 그것은 FBM 신경 세포의 이동에 미치는 영향을 연구하기 위해 미디어에 관심 생물학적 억제제를 추가 할 수 있습니다. 참고 : 구슬을 주입하거나 다른 치료를 관리하는 경우,이 실험이 성공적으로 설정되었는지 확인하기 위해 실험 당 정상적인 성장 조건에서 최소 2 제어 외식을 유지하는 것이 좋습니다. 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2)에 24 ~ 30 시간 동안 외식을 품어. 5. 후뇌 외식 Wholemount 면역 형광 염색법 각 우물에서 미디어를 대기음, PBS로 세척하고 얼음처럼 차가운 4 %의 포름 알데히드 (PBS에 녹인 4 % 파라 포름 알데히드를 새로 제조 또는 갓 해동)에서 교반과 함께 4 ° C에서 2 시간 동안 고정합니다. 참고 : 고정하기 전에 문화 삽입에서 후뇌를 제거하려고하지 마십시오완료됩니다. PBS로 3 회 씻어. 조심스럽게 뒤몽의 집게를 사용하여 문화 삽입에서 hindbrains 껍질. 일부 외식이 벗겨하기 어려운,하지만, 일반적으로 반복 피펫에서 PBS 추방을 통해 부드러운 압력을 적용하여 해제 할 수 있습니다. 면역 형광 라벨 2.0 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 hindbrains을 전송합니다. 온화한 회전으로 ​​0.1 % 트리톤-100 (PBT)을 함유하는 PBS에서, 실온 (RT)에서 30 분 동안 hindbrains을 투과. 부드러운 롤링과 10 %의 열 불 활성화 정상 염소 혈청을 포함하는 PBT에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. ISL1 특정 차 항체와 함께 5 일 동안 4 ° C에서 부드러운 롤링과 함께 외식을 품어, 1 % 열 불 활성화 정상 염소 혈청을 포함하는 PBT에서 1:100으로 희석. 15 분마다 PBT와 RT 배에서 외식을 씻으십시오. 형광 – 복합 염소 항 – 마우스 항체 (예 : 알렉사 플 루어 488 염소 항과 3 시간 동안 실온에서 부드러운 롤링과 외식을 품어마우스는 1 % 열 불 활성화 정상 염소 혈청을 포함하는 PBT에서) 1:200 희석. 외식 부드러운 회전과 15 분마다 PBT와 실온에서 4 배 씻으십시오. RT에서 30 분 동안 4 % 포름 알데히드에 이식편을 후위. 외식 용 포켓을 만들 검은 색 전기 테이프의 레이어와 메스 층 테이프의 작은 사각형 소비세와 유리 슬라이드 커버, 대안, 우울증 유리 슬라이드를 사용합니다. 포켓에 SlowFade 시약 각 후뇌를 탑재 조심스럽게 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 트랩 기포와 이미지에 방지, 유리 커버 슬립 커버. NOTE : 면역 염색에 대한 대안으로서, FBMS (즉 ISL1 또는 Phox2b)를 인식 리보 프로브와 함께 제자리 혼성화에 FBM 뉴런 16,21를 시각화하는데 이용 될 수있다. 단계와 타이밍의 개요 14 ~ 날짜 : E11.25 임신을 얻기 위해 짝짓기를 초과 선택 사항 : 비드 준비 (ProtocoL 1) : 배아 분리하기 전에 하루에 1 ~ 2 시간, 문화 삽입 및 미디어 (프로토콜 2)를 준비 ~ 30 분 전에 배아 분리 배아 격리와 후뇌 해부 (3.1-3.4 단계) : ~ 10 분 / 배 후뇌 해부 (3.5-3.7 단계) : ~ ~ 10 분 / 후뇌 이식편 절차 (3.8-3.9 단계) : ~ ~ 10 분 / 후뇌 선택 사항 : 구슬 주입 (3.10-3.11 단계) : ~ ~ 10 분 / 후뇌 이식편 문화 (단계 4.7) : 24 시간 항체 염색에 대한 고정 (단계 5.1) : 2 시간 염색 절차 및 영상 (프로토콜 5) : 5 일