在Wholemount大鼠视网膜免疫组化和钙成像方法

视网膜神经节细胞（RGC的）表达L，N，P / Q-和T-型VGCC通过整个细胞的这些成分的药理学阻断测定Ca通道电流^1,2。 VGCC是涉及递质释放，基因转录，细胞调节和突触可塑性^3,4,5该跨膜多聚体蛋白。官能VGCCs是由至少三种不同类的亚基组成：大，跨膜_α1孔形成在建立通道的生物物理和药理性质，主要是细胞外的辅助_α2δ亚基和胞内β亚基的亚基。后两种形式的异配合不同的α _亚单位和改变门控动力学的渠道质膜⁶和贩运。

在最近的几十年中，许多技术已被用于研究蛋白质expre裂变，如免疫组织化学，酶联免疫吸附测定法，western分析和流式细胞术。这些技术需要使用特定的抗体对于感兴趣的给定的蛋白质的检测，并提供本地化和特异性蛋白质的分布在不同组织中的有力工具。用于检测和定量特定蛋白质的mRNA表达水平的技术，例如Northern印迹分析，RT-PCR，实时定量RT-PCR， 原位杂交，cDNA芯片和核糖核酸酶保护测定法提供了另一种方法，当抗体是不容易特定的蛋白质可用，或者表达水平低^7。然而，一个限制，以使用这样的分子生物学技术是基因序列的所需鉴定。

在视网膜本地化蛋白，免疫组织化学可wholemount视网膜进行。由于视网膜神经节细胞的可及性，wholemount准备提供给特定蛋白质的本土化研究，以研资局胞体和轴突一个很好的平台。

除了其定位，VGCCs在视网膜神经节细胞的一些功能特性可以通过使用钙成像技术来证明。我们描述了钙成像协议选择性标记视网膜神经节细胞与钙指示剂染料测量细胞内钙离子动态。不同VGCCs来在不同的细胞区室中的钙信号的贡献可以分离与使用亚型特异性钙通道阻滞剂。

也许这里描述的钙成像技术的最有利的方面之一是，从多个视网膜神经节细胞和其轴突同时和独立地记录的能力。虽然许多生理技术，如全细胞膜片钳记录，提供膜电流的高时间分辨率的录音，躯体或采取这些轴突源记录ê电流不能歧视和录音只能从每次的单个神经元的进行。多电极阵列（MEAs）中能够从许多细胞同时记录的尖峰，但既不能检测或识别的激活，例如，不同的钙离子通道的亚型。 MEAS从细胞位于接近该给定的电极⁸和记录从细胞中产生大的尖峰⁹优先记录。光学成像方法提供了一种替代的策略，使细胞的整个种群可与从单细胞微电极和膜片钳记录和MEA记录中获得的信息结合起来的同时和独立记录。虽然这里所描述的钙成像技术被用于研究视网膜神经节细胞的钙动力学，膜片钳和多边环境也可使用在平行于进一步阐明离子电流和视网膜神经节细胞的动作电位发放。

<pCLASS =“jove_content”>由于流离失所无长突细胞组成的神经元群在小鼠视网膜¹⁰的神经节细胞层的约60％，我们的目标是利用装载技术，选择性地标记与视网膜神经节细胞的合成钙指示剂染料wholemount准备。虽然合成钙指示剂染料为细胞内钙离子动力学研究一个很好的平台，它的广泛使用已经阻碍无法给定的网络中有效地加载神经元的特定人群。如批量加载¹¹和电穿孔^8,12许多技术已被执行的加载单元的整个人群中，然而，这种技术不特定的细胞类型之间进行区分。遗传编码的钙指标提供以选择性标记的细胞的特定群体的能力，但是，这样的方法要求的转基因动物¹³的产生。我们的技术描述了其实​​现方法具d，来选择经由视神经断端注射钙指示剂染料的wholemount准备标记视网膜神经节细胞。

综上所述，本文中介绍的结构和生理技术提供研究视网膜神经节细胞和其轴突的定位和VGCCs的钙信号的作用的平台。