Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln
Summary
Multiplex-Assays können nützliche Informationen für grundlegende zelluläre Mechanismen und beseitigen Abfälle von Reagenzien und unnötig wiederholende Experimenten. Wir beschreiben hier ein Multiplex-Caspase-3/7 Aktivitätstest unter Verwendung von fluoreszierenden und lumineszier-basierte Verfahren, um die Lebensfähigkeit der Zellen di einem in vitro Modell Hypothalamus folgenden oxidativen Herausforderung mit Palmitinsäure bestimmen.
Abstract
Die Fähigkeit, Tests in Studien von komplexen zellulären Mechanismen Multiplexen beseitigt die Notwendigkeit für wiederholte Versuche, stellt die internen Kontrollen und verringert Abfall Kosten und Reagenzien. Hier beschreiben wir die Optimierung eines Multiplex-Assays, um die Apoptose zu beurteilen Ein Palmitinsäure (PA) Herausforderung di einem in vitro-Modell des Hypothalamus, unter Verwendung von sowohl Fluoreszenz-und Lumineszenz-basierten Assays, um lebensfähige Zellzahlen und Caspase-3/7-Aktivität in einer 96-Well-Messung Mikrotiterplatten-Format. Nach PA Challenge wurden lebensfähigen Zellen durch eine Resazurin-basierte Fluoreszenztest bestimmt. Caspase-3/7 Aktivität wurde dann unter Verwendung eines luminogenen Substrat, DEVD und normalisiert auf die Zellzahl. Dieses Multiplexing Assay ist eine nützliche Technik zum Bestimmen Änderung Caspase-Aktivität nach einer apoptotischen Stimulus, wie z. B. gesättigte Fettsäure Herausforderung. Die gesättigten Fettsäuren PA Hypothalamus oxidativen Stress und Apoptose zu erhöhen, was die potenziellen Einfuhrnz der Assays wie hier beschrieben in die Untersuchung der Beziehung zwischen gesättigten Fettsäuren und neuronalen Funktion.
Introduction
Ernährung reich an gesättigten Fettsäuren, wie Palmitinsäure (PA) haben, Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes 1, 2 verbunden worden. Hohe Fett-Diäten haben auch gezeigt, dass oxidativer Stress, Apoptose und neuronale Degeneration im Hypothalamus, einem wichtigen Regulator der Appetit und Energieaufwand 3-7 erhöhen. Das Verständnis der Mechanismus, durch den hohen Fett-Diät-Exposition induziert Hypothalamus Dysregulation ist somit wichtig für die Entwicklung von pharmakologischen Behandlungen für Übergewicht. , Die zellulären Mechanismen, durch die Nahrungsfett beeinflusst die neuronale Funktion bleibt jedoch unklar. Ein besseres Verständnis, wie Fette, wie PA könnte Einsetzen der Hypothalamus-apoptotische Signalwege auslösen, ist ein notwendiger erster Schritt hin zu diesem Ziel. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Multiplex-Assays für in-vitro-Tests der neuronalen Antwort auf PA Exposition, für den Einsatz in Studien von h entwickelt beschreibenypothalamic Neurodegeneration. Wir liefern eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-well Format Multiplex-Assay zur Messung der Caspase 3/7 Aktivität pro Gesamtzahl der Zellen in einem differenzierten verewigt erwachsenen Maus Hypothalamus-Zelllinie (A12 bezeichnet) nach oxidativer Herausforderung mit PA-8.
Kurz gesagt, wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach PA Herausforderung über ein Resazurin basierte Assays bestimmt. Resazurin ist eine Zelle durchlässige Verbindung, die enzymatische Reduktion in metabolisch aktiven Zellen unterzogen, um ein Verfahren, dachte über die Mitochondrien 9 auftreten. Lebensfähige Zellen kontinuierlich Resazurin zu Resorufin zu konvertieren, wodurch ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen. Caspase-3/7 Aktivität wird dann unter Verwendung eines DEVD-basierten Assay lumogenic. DEVD eine Aminosäure-Sequenz (Asp-Glu-Val-Asp) von Caspase-3 gespalten wird. Wenn diese Sequenz mit einer lumogenic Substanz bei Aktivierung des intrazellulären Caspase-3/7 und anschließende Spaltung gekoppelt ist,DEVD von Substrat wird die lumineszierende Produkt freigesetzt. Diese Reaktion ist proportional zu Caspase-Aktivität und damit zur Induktion von Apoptose. Da tote Zellen nicht Caspase zu erzeugen, ist Caspase-3/7 Aktivität von Natur aus vergänglich; Analyse daher sollte zwischen 30 min bis 4 Stunden nach der Herausforderung, je nach Wirksamkeit der Zell Stressor abgeschlossen werden. Zelllebensfähigkeit ist umgekehrt proportional zu der Caspase-3/7 Aktivität und kann verwendet werden, um zu bestimmen Mechanismen des Zelltods. Beispielsweise wurde dieses Verfahren bisher verwendet worden, um diese Vorbehandlung mit dem Peptidhormon Orexin verringert die Apoptose in Zellen des Hypothalamus mit Wasserstoffperoxid in Frage, was darauf hindeutet, dass die Mechanismen durch diese Behandlung nicht betroffen sind beim Schutz gegen oxidative Schädigung 10 wichtig zu zeigen. Es ist wichtig zu beachten, diese Tests sind Zelllinie-und gewebeabhängig, wie sie verlassen sich auf die mitochondriale Aktivität Assay-Reagenzien zu reduzieren. Dieses Protokoll wurde für erwachsene Maus Hypothalamus (A12) Zellen optimiert; jedochbeschriebenen Verfahren geändert werden, um im Rahmen der Forschung ähnlich zu passen.
Multiplexing-Tests aus einer einzigen Kultur und bietet einen Vorteil gegenüber der traditionellen Methode der Durchführung einzelner Tests aus mehreren Gründen. Neben der Zeitersparnis, Zellproben, Reagenzien und Kultur kann auch Multiplex-Assays Wissen des Zellüberlebens und Tod, stellen interne Kontrollen, und die Notwendigkeit für Wiederholungsversuche 11, 12.
Alternative Methoden haben sich auf Western-Blots oder ELISAs, die zuverlässig sind Tests verlassen, sind aber teuer und zeitaufwändig (1-2 Tage), insbesondere bei der Verwendung eines 96-Well-Format. Außer der Zeit, die zur Kultivierung von Zellen für die Multiplexassay, ist die Gesamtzeit von weniger als 3 Stunden. Während dieses Protokoll wurde für die Verwendung mit A12-Zellen optimiert wurde, kann es für den Einsatz in anderen Modellen verändert werden, ohne dass dabei Faktoren, die die Integrität der Zelle beeinflussen können. AbschreckenBergbau, wenn dieses Protokoll für eine Reihe von Experimenten funktionieren würde, hängt von der Anzahl der Proben oder experimentellen Bedingungen und über geplante nachgeschalteten Experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Multiplex-Assay ist ein gut anerkanntes Verfahren, die von Wissenschaftlern in zahlreichen Anwendungen wie PCR-Mikroarrays, Immun und andere Protein-basierten Nachweismethoden 13, 14 verwendet wurde. Kürzlich, Multiplexing-Tests haben sich in den in-vitro-Platte-basierte Experimente zunehmend genutzt und haben als eine genaue Methode zur Bewertung der Zytotoxizität validiert und Lebensfähigkeit 12. In dem obigen Protokoll zeigen wir die Wirksamkeit der Multiplex-Fluoreszenz-und Lumi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die hier beschriebene Arbeit wurde durch das US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory Forschung und Entwicklung BX001686-1A1 und VA Rehabilitation Forschung und Entwicklung finanziert.
Materials
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
Riferimenti
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