استخدام كاسباس المتعدد الفحص لتحديد موت الخلايا المبرمج في المهاد الخليوي نموذج

تم الوجبات الغذائية الغنية بالأحماض الدهنية المشبعة مثل حمض البالمتيك (PA) ترتبط السمنة والأمراض المصاحبة الأخرى، بما في ذلك أمراض القلب والشرايين والسكري ^{1 و 2.} وقد تبين أيضا الوجبات الغذائية عالية الدهون لزيادة الاكسدة، موت الخلايا المبرمج، وتنكس الخلايا العصبية في منطقة ما تحت المهاد، وهو منظم المهم الشهية والطاقة النفقات ^3-7. فهم الآلية التي من خلالها التعرض حمية عالية الدهون يؤدي التقلبات طائي بالتالي، من المهم لتطوير علاجات الدوائية للسمنة. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية من خلالها الدهون الغذائية يؤثر على وظيفة الخلايا العصبية تظل غير واضحة. فهم أفضل لكيفية الدهون مثل السلطة الفلسطينية قد تؤدي ظهور مسارات أفكارك طائي هو خطوة أولى ضرورية نحو هذا الهدف. الهدف من هذه المقالة هو لوصف مقايسة متعددة في المختبر لاختبار استجابة الخلايا العصبية للتعرض للسلطة الفلسطينية، وضعت لاستخدامها في دراسات حتنكس عصبي ypothalamic. نحن نقدم وصفا مفصلا ل96 جيدا شكل فحص في المختبر متعددة لقياس كاسباس 3/7 النشاط في العدد الكلي للخلايا في خلد الماوس الكبار خط متباينة طائي الخلية (المعين A12) بعد التحدي التأكسدي مع السلطة الفلسطينية ^8.

لفترة وجيزة، ويتحدد بقاء الخلية التالية تحديا للسلطة الفلسطينية عن طريق فحص ريسازورين القائمة. ريسازورين هو مركب نفاذية الخلية التي يخضع الحد الأنزيمية في خلايا نشطة أيضي، وهي عملية يعتقد أن تحدث عن طريق الميتوكوندريا ^9. تحويل خلايا قابلة للحياة باستمرار ريسازورين لresorufin، وتنتج إشارة الفلورسنت يتناسب مع عدد من خلايا قابلة للحياة. ثم يتم تحليل النشاط كاسباس 3/7 باستخدام مقايسة lumogenic مقرها DEVD. DEVD هو تسلسل الأحماض الأمينية (آسيا والمحيط الهادئ، غلو، فال ASP) المشقوق من قبل كاسباس 3. عندما يقترن هذا التسلسل إلى مادة lumogenic، على تفعيل الخلايا كاسباس 3/7 والانقسام اللاحقةمن DEVD الركيزة، يتم تحريرها المنتج الانارة. هذا رد فعل يتناسب مع النشاط كاسباس وبالتالي إلى استحثاث موت الخلايا المبرمج. كما الخلايا الميتة لا يمكن ان تنتج كاسباس، كاسباس 3/7 النشاط هي عابرة الطبيعة؛ ولذلك ينبغي أن يكتمل تحليل ما بين 30 دقيقة إلى 4 ساعات بعد التحدي، وهذا يتوقف على فعالية الضغوطات الخلية. بقاء الخلية يتناسب عكسيا مع نشاط كاسباس 3/7، ويمكن استخدامها لتحديد آليات موت الخلايا. على سبيل المثال، قد سبق استخدام هذا الأسلوب لإظهار أن المعالجة مع هرمون الببتيد أوريكسين يقلل موت الخلايا المبرمج في الخلايا طائي تحدى مع بيروكسيد الهيدروجين، مما يوحي بأن آليات تتأثر بهذا العلاج مهما في حماية ضد الضرر التأكسدي ^10. من المهم أن نلاحظ هذه المقايسات والخط والتي تعتمد على الخلايا والأنسجة، كما أنها تعتمد على النشاط الميتوكوندريا للحد من الكواشف مقايسة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للماوس الكبار طائي (A12) الخلايا؛ ومع ذلك،يجوز تغيير الأساليب المذكورة لتدخل ضمن نطاق البحوث مماثلة.

المقايسات المتنوعة من ثقافة واحدة ويوفر أيضا ميزة على الطريقة التقليدية في أداء فحوصات فردية لعدة أسباب. بالإضافة إلى توفير الوقت وعينات الخلايا، والكواشف والثقافة، ويمكن أيضا تقديم المقايسات مضاعفة المعرفة من بقاء الخلية والوفاة، وتوفير الضوابط الداخلية، والقضاء على الحاجة لإجراء التجارب المتكررة ^{11، 12.}

وقد اعتمدت أساليب بديلة على البقع أو ELISAs الغربية، والتي هي فحوصات موثوق بها، ولكنها مكلفة وتستغرق وقتا طويلا (1-2 أيام)، وخاصة عند استخدام تنسيق 96 جيدا. باستثناء الوقت الذي يستغرقه لخلايا الثقافة للمقايسة مضاعفة، مرة إجمالية تبلغ أقل من 3 ساعة. في حين تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع A12 الخلايا، فإنه يجوز تغيير لاستخدامها في نماذج أخرى مع الحفاظ في الاعتبار العوامل التي قد تؤثر على سلامة الخلية. ردعإذا التعدين هذا البروتوكول سيعمل على سلسلة من التجارب يتوقف على عدد من العينات أو الظروف التجريبية والتجارب على المصب المخطط لها.