L'incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

1. Preparazione del modello di DNA Purificare plasmide da un ceppo standard di laboratorio di E. coli, come E. coli DH5a o Nova blu con un kit commerciale. Alternativamente, un prodotto di PCR lineare può essere purificato in modo simile con un kit commerciale. Eluire il DNA con H 2 O solo. Fenolo-cloroformio estrarre la soluzione di DNA 26. Determinare la concentrazione di DNA e la purezza, ad esempio mediante assorbimento UV o altri metodi idonei. È importante utilizzare il DNA altamente puro per efficiente trascrizione-traduzione. 2. Preparazione del Thin Film Lipid Pesare la polvere secca lipidica e sciogliere in solvente. Per 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), le soluzioni madre sono preparati in cloroformio ad una concentrazione di 40 mg / ml. Nota: Solventi organici devono essere sempre maneggiati con pipette di vetro e bottiglie. In altre parole, non deve mai essere usata plastica. Conservare ssoluzioni tac in stretto, bottiglie di vetro aria solvente resistenti ambra a -20 ° C, preferibilmente sotto argon. Aliquota 12 micromol POPC (220 ml di 40 mg / ml di soluzione) in un pallone a fondo tondo da 5 ml. Evaporare il solvente con un evaporatore rotante (Figura 1) per generare il sottile film lipidico. Montare saldamente il pallone al tubo di distillazione con un fermaglio circolare e avviare la rotazione del pallone. Avviare la circolazione di acqua attraverso la serpentina del condensatore. Utilizzando un bagno di calore non è necessario, perché cloroformio ha un basso punto di ebollizione di 61,2 ° C a pressione atmosferica normale. Assicurare che il sistema è aperto all'atmosfera controllando che il rubinetto è aperto. Accendere la pompa del vuoto e chiudere lentamente il rubinetto di applicare il vuoto al sistema. Un sottile film lipidico si deposita sulle pareti del pallone durante evaporazione rotante formando una pellicola opacache è visibile ad occhio. Lasciate che l'evaporazione rotante proseguire per 0,5-2 ore. Per arrestare il processo, rilasciare lentamente la pressione del vuoto, fermare la rotazione, e togliere il pallone a fondo tondo. 3. Lipid risospensione e Vesicle omogeneizzazione Aggiungere 1 ml 18,2 MW H 2 O al film lipidico sottile direttamente nel pallone a fondo tondo. Vortice vigorosamente la soluzione alla massima velocità, circa 3.200 rpm, finché il film lipidico stacca dal vetro, che è osservabile ad occhio. Trasferire la dispersione dei lipidi in una provetta da 2 ml. Set-up di un anello stand per tenere un omogeneizzatore con una punta di 5 mm. Posizionare un supporto sotto il microcentrifuga omogeneizzatore per tenere saldamente la dispersione dei lipidi. Risciacquare l'elemento disperdente del omogeneizzatore immergendo la punta in 18,2 MW H 2 O e funzionante per alcuni secondi. Posizionare l'elemento disperdente direttamente nella dispersione lipidica garantendo thsulla punta non tocchi il fondo della provetta. Omogeneizzare per 1 min a livello di potenza 4 o 14.000 rpm. 4. Vescicola Estrusione e liofilizzazione Assemblare le parti della mini-estrusore (Figura 2), che consiste in un involucro esterno e un dado di bloccaggio che ospita due membrane teflon interno supporta, due O-ring, e un cuscinetto Teflon. Posizionare i due O-ring nelle scanalature dei supporti membrane interne. Prewet due filtri e una membrana 400 nm. I filtri saranno collocati contro il Teflon all'interno degli O-ring con la membrana tra loro. Posizionare la membrana supporta nella guaina estrusore con la membrana circondato da due filtri in fra gli O-ring. Posizionare il cuscinetto in teflon all'interno del carter e fissare il dado di fermo e serrare a mano. Risciacquare due siringhe e riempire uno con 18,2 MW acqua. Inserire gli aghi della siringa nel piccolo holes in teflon su entrambe le estremità del gruppo estrusore. Gli aghi devono scivolare nel facile, non forzare gli aghi. Fissare l'estrusore con le siringhe nel corpo estrusore e fissare. Passare l'acqua attraverso l'estrusore premendo lentamente l'acqua fuori una siringa e nell'altro. Questo rappresenta un passaggio. Ripetere per un totale di tre passaggi di assicurare che non vi siano perdite presenti. Rimuovere la siringa di acqua e smaltire l'acqua. Riempire una siringa con il campione, allegare l'estrusore, e lentamente passare la soluzione attraverso la membrana vescicola come descritto sopra nel passo 4.3. Ripetere 10 volte per un totale di 11 brani. Dell'andamento del processo di estrusione, il campione diventa meno torbido e facile spingere attraverso la membrana. Una improvvisa diminuzione della resistenza, comunque, di solito indica una rottura della membrana. Trasferire la soluzione vescicola estruso e fare 40 microlitri aliquote delle vescicole in provette da microcentrifuga.Flash congelare ciascuna aliquota in ghiaccio secco o in azoto liquido. Lyophilize ciascuna aliquota con un evaporatore centrifugo notte a 30 ° C. Conservare le vescicole vuote liofilizzate a -20 ° C. 5. Incapsulando meccanismi di trascrizione-traduzione Miscelare i componenti della reazione di trascrizione-traduzione e aggiungere 20 unità di inibitore della RNasi. Incubare in ghiaccio. Aggiungere il modello di DNA. Per una reazione di controllo, 250 ng di plasmide mVenus codifica una proteina fluorescente o simile dietro un promotore trascrizionale T7 e un forte E. coli sito di legame del ribosoma è raccomandato. Portare il volume finale di 25 microlitri di acqua priva di RNasi. Idrato una aliquota di vescicole liofilizzati (dal punto 4.6) con 10 microlitri della reazione assemblato nel passo 5.3. Brevemente vortex la miscela fino a quando le vescicole sono risospesi. Questo dovrebbe richiedere meno di 30 sec. Incubare la reazione in ghiaccio per 30 min per permettere le vescicole a gonfiarsi. Diluire la miscela vescicola 20 volte ad un volume totale di 30 microlitri con l'aggiunta di 1,5 ml di vescicole in 27,0 ml di 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 e 1,5 ml di 20,2 mg / ml di proteinasi K. DNasi e RNasi possono anche essere aggiunti a questo punto come alternativa alla proteinasi K a degradare materiale extravesicular. Incubare per almeno 2,5 ore a 37 ° C. 6. Microscopia Esaminare le vescicole e il progresso della produzione di proteina fluorescente in momenti diversi. Le vescicole avranno un diametro maggiore rispetto alle 400 nm pori di dimensioni della membrana utilizzata per vescicola estrusione. Preparare una camera del campione mettendo un 20 x 5 mm distanziale di silicio su un vetrino da microscopio standard. Pipettare 10 ml di vescicole nell'apposita camera. Posizionare un vetrino di vetro siliconato sopra la camera. Osservare le vescicole con un 63X olio-dispersione or obiettivo analogo da campo chiaro e microscopia a fluorescenza con filtro corrispondente per la proteina fluorescente sfruttati.