Summary

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Published: June 04, 2014
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Summary

Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

Abstract

Bien que de courte durée, la mitose est un processus multi-étapes complexe et dynamique fondamentale pour le développement des organes, y compris le cerveau. Dans le cortex cérébral en développement, la mitose anormale de cellules progénitrices neurales peut causer des malformations à la taille et la fonction du cerveau. Par conséquent, il existe un besoin critique des outils pour comprendre les mécanismes de neurones progéniteurs mitose. Développement cortical chez les rongeurs est un modèle exceptionnel pour l'étude de ce processus. Progénitrices neurales mitose est souvent examiné dans les sections du cerveau fixes. Ce protocole décrit en détail une approche de l'imagerie en direct de la mitose en ex vivo des tranches de cerveau embryonnaires. Nous allons décrire les étapes essentielles de cette procédure, qui comprennent: l'extraction du cerveau, intégration, vibratome découpe des tranches de cerveau, la coloration et la culture de tranches, et imagerie time-lapse. Nous allons ensuite montrer et décrire en détail comment effectuer une analyse post-acquisition de la mitose. Nous incluons résultats représentatifs from ce dosage en utilisant le colorant vital Syto11, des souris transgéniques (histone H2B-EGFP et centrine-EGFP), et l'électroporation in utero (mCherry-α-tubuline). Nous allons discuter de la façon dont cette procédure peut être mieux optimisé et comment il peut être modifié pour l'étude de la régulation génétique de la mitose. Imagerie en temps réel de la mitose dans des tranches de cerveau est une approche souple pour évaluer l'impact de l'âge, de l'anatomie, et la perturbation génétique dans un environnement contrôlé, et de générer une grande quantité de données avec une résolution spatiale et temporelle. Ainsi ce protocole vient compléter les outils existants pour l'analyse des neurones progéniteurs mitose.

Introduction

L'objectif global de ce protocole est de décrire comment effectuer l'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans des tranches de cerveau embryonnaires. En utilisant l'imagerie en direct de tranches de cerveau de la culture, ce protocole fournit une méthode simple pour analyser les multiples aspects de la mitose dans les progéniteurs neuronaux dans un environnement très similaire à un cadre in vivo. Il peut être appliqué sur le cerveau des animaux et / ou les cerveaux mutantes qui ont été manipulés par électroporation in utero) 5.1. Cette technique est également idéal pour tester l'effet d'agents pharmacologiques sur la mitose de précurseurs neuronaux, par le simple ajout d'un agent pour le milieu de culture. En somme, cet article va faire un protocole défi technique accessible à ceux qui étudient la neurogenèse.

Au cours de la neurogenèse, les populations progénitrices neurales distinctes subissent divisions précises pour générer des neurones qui contribuent finalement à six couches corticales de l'adulte néocortex 6-8. Au début du développement cortical, la piscine de précurseur neural se développe comme neuroépithéliales (NE) les cellules se divisent de manière symétrique à se renouveler. cellules NE transforment en cellules gliales radiales (CGR). Initialement CGR divisent symétriquement à produire deux nouveaux CGR, mais pendant la plus grande partie de la neurogenèse, principal mode de CGR de division est asymétrique. Dans la division asymétrique, une RGC donne lieu à un nouveau RGC et soit un neurone post-mitotique, ou un progéniteur plus spécialisé (soit un précurseur neuronal court (SNP), une glie radiale externe (ORG), ou un progéniteur intermédiaire (INP) 2,3,7,9. INP, SNP, et ORG peuvent alors générer des neurones à la sous-ventriculaire, ventriculaire, et les régions du cortex basaux, respectivement. conséquent, la division cellulaire des progéniteurs est un processus fondamental pour générer des neurones de l' néocortex.

De nombreuses études font état d'une corrélation entre les traits spécifiques de la mitose CGR et le destin des cellules filles. Haydar et al. Et Takahashi et al.ont montré que RGC durée mitotique et augmentation de la longueur du cycle cellulaire comme neurogenèse produit, une constatation fait écho dans le suivi des études 10-13. Un certain nombre d'études ont suggéré que fuseau mitotique orientation par rapport au ventricule influe sur les aspects de la neurogenèse et corticogenèse, y compris les types de neurones générés et le placement de la descendance dans le cerveau, respectivement 3,10,14-16. Que plan de clivage orientation influe directement sur le destin des cellules est controversée, mais la conclusion reste que cette mitotique impacts de paramètres neurogenèse. Souligne en outre l'importance de la mitose est l'observation que de nombreux gènes impliqués dans les mécanismes de la mitose sont cruciales pour la neurogenèse et de bon développement du cerveau 17-20.

La mitose est un processus dynamique, encore à ce jour la plupart des études détaillant progénitrices neurales mitose utiliser l'analyse des coupes de tissus fixes ou imagerie de progéniteurs neuronaux via la culture de cellules in vitro. Ainsi, les procédés traditionnels pour évaluer la mitose ne fournissent qu'un aperçu de ce processus et ne parviennent pas à découvrir comment les cellules se comportent dans un tissu. L'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose est progressivement devenu un outil essentiel pour comprendre la fonction neuronale progénitrice. Pour des exemples s'il vous plaît voir ces références 4,8,10,21-25. Plusieurs protocoles en circulation ont été publiées pour la préparation et l'imagerie des tranches de cerveau 26,27. Toutefois à ce jour, un protocole détaillé pour l'imagerie et l'analyse de la mitose n'a pas été décrite ni démontré dans la vidéo.

Cette technique offre plusieurs avantages importants par rapport à l'analyse fixe de coupes de cerveau. Analyse Time-lapse de tranches de cerveau permet la génération de beaucoup plus de points de données qui peuvent être analysées de manière flexible. Tout d'abord, les données sont collectées à des instants individuels sur une période de plusieurs minutes ou plusieurs heures. On peut analyser des points de temps individuels (pour créer un montage statique) oupeut combiner différents moments dans les films. Deuxièmement, l'imagerie confocale de tranches permet la génération de données au niveau des sections de Z différents dans des tranches de cerveau. En conséquence, les sections individuelles peuvent être analysées. En variante, des piles de sections individuelles peuvent être combinées en une projection d'intensité maximale. Troisièmement, l'analyse se fait dans le cadre d'un tissu, révélant comment les cellules se divisent par rapport à des cellules et des structures voisines. Quatrièmement, il est parfaitement adapté à l'analyse de mutants qui montrent des signes de défauts mitotiques. Ensemble, ce protocole permettra de clarifier les étapes critiques pour aider les chercheurs qui souhaitent faire de l'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans leurs propres laboratoires.

Protocol

1. Préparation des milieux (figure 1, étape 1) Tranche milieu de culture 25 ml de milieu de culture de la tranche est suffisante pour préparer des plats de fond 5 de verre avec deux tranches par puits. Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 250 ul d'une solution de N2 100x et 500 ul d'une solution 50x B27 sans vitamine A. Ajouter DMEM/F12 à un volume de 22,5 ml. Stériliser par filtration, puis ajouter une solution de 1,25 ml de sérum de cheval inactivé à la chaleur…

Representative Results

Le succès de cet essai et l'observation de plusieurs cellules en mitose au cours d'une session live d'imagerie dépendent en grande partie à la fois l'intégrité et le niveau anatomique de la tranche où les acquisitions sont réalisées. Comme discuté ci-dessous, le niveau anatomique d'une tranche est un facteur important. Figure 3A montre rostro-caudale et médio-latérale des endroits où nous avons le mieux réussi. Pour une discussion supplémentaire sur ce sujet s'il vo…

Discussion

L'avantage majeur du protocole que nous avons décrit est qu'il fournit une résolution temporelle dynamique de la mitose de cellules progénitrices neurales. Typiquement, les dosages de visualiser la mitose dans le cerveau en développement sont effectuées par immunofluorescence de coupes de tissus fixés. Mais cette approche ne donne qu'un aperçu de la mitose à un point de temps.

Il existe plusieurs étapes qui sont les plus critiques pour l'imagerie de la mitose dans de…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent financement du NINDS / NIH, R00-NS064197 et NINDS / NIH, R01NS083897 (à la fois pour DLS).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
100X N2 Life technologies 17502048 for culture medium
50X B27 without vitamin A Life technologies 12587010 for culture medium
DMEM/F12 Life technologies 11320033 for culture medium
Heat-inactivated horse serum Sigma Aldrich H1138-500ml for culture medium
Heat-inactivated calf serum Sigma Aldrich F4135-500ML for culture medium
FGF R&D Sytems 3139-FB-025 for culture medium
EGF for culture medium
10X HBSS Life technologies 14065-056 for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid Sigma Aldrich  H4034 dilute to 1M (pH7.4)
2.5M D-Glucose Sigma Aldrich G8769 for the dissection of the embryos
0.9M NaHC03 Life technologies 25080-094 for the dissection of the embryos
low-melting agarose Fisher  BP165-25 for generating slices
Loctite 404 glue Loctite 404 46551 keep at 4˚C
syto11 Life technologies S7573 Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I  Life technologies A1048301 for culturing slices
glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C for culturing slices
petri dishes for dissection of the embryos
digital thermometer to measure the temperature of the agarose
spatula to transfer brains
paintbrush alternative to transfer brains
vibratome Leica VT1000s for generating slices
dissecting microscope dissecting out embryos
imaging microscope A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Pilaz, L., Silver, D. L. Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex. J. Vis. Exp. (88), e51298, doi:10.3791/51298 (2014).

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