JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Sıralanması<em> Streptomyces</emKarmaşık bir nesne Parametrik Analiz ve Ayırıcı Kullanma> Hücre Peletleri

Published: February 13, 2014
doi:
10.3791/51178
, , ,
1Microbial Biotechnology, Institute Biology Leiden,Leiden University, 2Microbiology, Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation,Utrecht University

Summary

Sıvı yetiştirilen Streptomyces kültürleri boyut olarak heterojen misel topaklar ile karakterize edilir. Burada analiz etmek için bir yöntem tarif ve yüksek verimli bir şekilde bu sıralama peletler. Bu pelet büyüme heterojenitesini anlamak ve kontrol etmek için yol sağlayacak ileri analizler için kullanılabilir.

Abstract

Streptomisetler enzim ve antibiyotik üretimi için endüstride kullanılan ipliksi toprak bakterilerdir. Biyoreaktörlerde yetiştirildiğinde, bu organizmalar boyut olarak heterojen granül olarak bilinen, birbirine hif ağları oluşturan. Burada analiz etmek için bir yöntem tarif ve sıralama misel topakları karmaşık bir nesne Parametrik Analiz ve Sıralayıcısı (COPAS) kullanarak. Detaylı talimatları alet ve verilerin istatistiksel analizi temel kullanımı için verilmiştir. Biz ayrıca bu tür RNA veya protein içeriğinin analizi olarak aşağı işlenmesini sağlayan, kullanıcı-tanımlı ayarlara göre pelet sıralanabilir anlatacağız. Bu metodoloji kullanarak mekanizma yatan heterojen büyüme ele olabilir. Bu verimlilik pelet büyüklüğü ile ilişkilidir gerçeği göz önünde bulundurarak, bir hücre fabrikası olarak Streptomycet'ler geliştirmek için vesile olacaktır.

Introduction

Streptomisetler filaman toprak iyi antibiyotik için kendi yeterlilik için bilinen bakteri, hem de bağışıklık bastırıcı ya da mantar enfeksiyonlarının ya da kanser 1,2 mücadele etmek için kullanılabilir bileşiklerdir. Buna ek olarak, bu organizmalar endüstriyel uygulamalar 3 geniş bir aralığı için ilgi çekici olan enzimleri üretir. Ticari olarak ilgi çekici bileşiklerin çoğu, biyo-reaktörlerde üretilir. Biyoreaktörlerde Streptomisetler büyüme kümeleri veya granül olarak bilinen, birbirine hif kompleks yapıların oluşumu ile karakterizedir. Bu çok hücreli yapılar büyüklüğü 4 ile ilgili son derece heterojen ve Escherichia coli veya Bacillus subtilis gibi tek hücreli bir bakterinin daha fazla bir milyon kat daha büyük boyutlarda ulaşabilirsiniz. Heterojenlik, doğal biyolojik sistemlerde 5 faydalı bir özellik olarak kabul edilmektedir, ancak, bu sektörde, üretim tuzak olarak kabul edilir. BioReaktör kültivasyonları mümkün olan en yüksek verimi elde etmek için tekrarlanabilir ve denetlenebilir olması gerekir. Bir biyoreaktör içinde topak tiplerinin her birinin rolü detaylı bir anlayış, bir hücre fabrikası gibi Streptomisetler geliştirmek için, bu nedenle çok önemlidir.

Akış sitometrisi yaygın bir popülasyonda 6 tek tek hücrelerin analiz etmek için kullanılır. Akış sitometrelerinde aynı anda (örneğin büyüklüğü, yoğunluğu ve renkli floresan gibi) hücrelerin özelliklerini ölçerek multiparametrik bilgi edinebilirler. Bu şekilde, hücre özellikleri böylece eden bir kültürün içinde heterojenite anlaşılması ve hücrelerin 6 farklı popülasyonlarının varlığı katkıda ilişkili olabilir. Daha özelleşmiş enstrümanlar kullanıcı-tanımlı parametrelere göre mümkün hücreleri sıralamak için yaptık. Örneğin, mutantlan taranabilir. Sıralama sonra, bu tür mutant hücreler daha fazla karakterizasyon için yetiştirilebilir. Bu zaten diğerleri arasında, yararlı olduğu kanıtlanmıştır,suşları 7,8 verimliliğini artırmak için. Akış sitometre Memeler, tipik olarak yaklaşık 10 um arasında bir maksimum çapa sahip hücrelerin geçişine izin verir. Bu nedenle, Streptomycet'ler topakları düzenli akış sitometrelerinde ile analiz edilemez. Bununla birlikte, Kompleksi Nesne Parametrik Analyzer ve Sıralayıcısı (COPAS) ile analiz edilebilir. Düzenli bir akış sitometrelerinde gibi, COPAS yüksek verim şekilde parçacıkların multiparametrik veri elde edebilirsiniz. Copas türüne bağlı olarak, 10-1,500 um büyüklüğünde parçacıklar, analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu tür DNA, RNA ya da protein izolasyonu olarak kültivasyonu veya alt analizler için kullanılabilir bireysel partiküllerin, sıralama için olanak sağlar. COPAS başlangıçta örneğin nematod Caenorhabditis elegans 9 ve Drosophila embriyolar ve larva 10 gibi küçük hücreli organizmaların, analiz ve sıralama için tasarlanmıştır. Araçlar da Zebra balığı 11 a süredir kullanılmaktadırnd ipliksi mantarlar 12,13 için. Bu ikinci filaman organizmalar da bakteriler tarafından oluşturulanlar daha büyük olan misel topakları oluşturulur. Yakın zamanda copas kullanımı da Streptomisetler 4 için uygun olduğunu göstermiştir. Burada ölçülerine uygun granül sıralamak için yöntem ile ilgili bilgileri de dahil olmak üzere, Streptomyces coelicolor pelet heterojen değerlendirmek için copas kullanmak için deney prosedürü açıklar. Bu yöntem aynı zamanda, diğer topak oluşturucu Streptomisetler analizi için kullanılabilir ki, lütfen unutmayın.

Protocol

Iki günlük eski sıvı büyütülmüş kültürden sıralama Streptomyces pelet analiz ve işlem şematik olarak Şekil 1 'de temsil edilir. Yöntem için ayrıntıları aşağıda verilmiştir. 1.. (Medya ve Tamponlar hazırlanması dahil) Büyüme 10x fosfat tamponlu tuzlu su 1 L hazırlanması (PBS, 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g 2 HPO 4, pH 7.4 'e ayarlandı damıtılmış su, 1 L 2.4 g KH 2 PO 4 Na). Kullanım sırasında PBS içinde 1 L elde etmek üzere damıtılmış su içinde 900 ml 10x PBS 100 ml. Yeme ortamı 1 L hazırlayın (3 g Difco maya özütü, 5 g Bacto pepton, 3 g Oxoid malt özü, 10 g glukoz, 340 g sakaroz, 1 L damıtılmış su kadar) ve 2.5 M MgCI2, 100 ml. Otoklav hem çözümler sterilize edin. Başka Streptomyces ortamı 4,14 kullanılabilir unutmayın. Bir 100 ml yeme orta ve 0.2 ml 2.5 M MgCl2 eklemesteril 250 ml Erlenmeyer şişeye metal sarmal yay ile donatılmıştır. Çalışma bakteri örnekleri olduğu kadar çok şişeler hazırlayın. 10 6 spor / ml 'lik bir spor konsantrasyonunun elde edilmesi için Streptomyces 10 8 sporları, her şişe inoküle. 180 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de 2 gün boyunca bakteri büyütün. 2. Örnekleme 5 ml steril bir pipet kullanarak 15 ml Falcon tüpüne her kültürden 5 ml örnek aktarın. Numune bütün kültür için temsili sağlamak için numune alma sırasında yavaşça kültür çalkalanır. Numuneler COPAS ile hemen analiz edildiğinde hiç numune hazırlama adım gereklidir. Buz üzerinde örnek tutmak ve bu protokolün 3.1 adıma geçin. Numuneler daha sonraki bir zaman noktasında incelendiğinde, adımlar bu protokolün 2,3-2,5 açıklandığı gibi granül düzeltin. Uygun şekilde analizana sonra temizlenmiş zaman tespit da boru sistemindeki bakteri büyümesini engeller unutmayınes. Formaldehit aşağı analizleri engellemektedir değildir ile bu sabitlenmesini sağlamak. Örneğin, RNA formaldehid ile tespit sonrası mantar granül izole edilemedi. Bunun aksine, RNA başarılı bir şekilde% 70 etanol 12 ile tespit sonra izole edildi. Numunenin, 5 ml% 37 formaldehit 600 ul ilave edin ve 3 kez tüp ters çevirerek karıştırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri düzeltildi. Santrifüj 10 dakika boyunca 4 ° C 'de sabit bir rotor içinde 2,500 x g de örnekler. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 5 ml PBS ile granül yıkayın. Peletler 2x PBS ile yıkanmakta, böylece adım 2.4 tekrarlayın. Numuneler bir kaç hafta boyunca 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir. 3. COPAS Analizi COPAS Artı, pompa, bilgisayar ve 488 nm argon lazer açık ve Biosort yazılımı başlatmak emin olun. Açık olsa da, lazerin bekleme modus olacaktır. Kılıf sıvısı şişesi dolu ve kontrol edinatık şişesi boş. Üzerinde bekleme konumundan 488 nm argon lazer geçiş ardından 'start' ve 'RUN' tıklayın. Lazer açıkken sonra yaklaşık 60 sn, 'YAPILDI' tıklayın. Basınç göstergelerini kontrol edin. 'Kılıf' için baskılar, 'Örnek', 'Sıralayıcısı' ve 'Temiz' sırasıyla yaklaşık 4.0, 0.5, 2.7, ve 10,9 okumalısınız. Bir sonraki 'Basınç OK' için onay kutusunu tıklatın. Sistem daha sonra akış hücresi hazırlar ve kullanıma hazırdır. Standart ayarlar 11, 'Erteleme' ve 'Genişlik' 7 ile kabul edilir. Eşikleri-saati uçuş temsil TOF ile, 'TOF Minimum' için 'Sinyal' için, 50 ve 40 olarak ayarlanır. (Bütünlüğü için: Bütün 'kar' 1 ayarlanır, tetik 2.50 MHz seçilir 'tarama hızını seçin' EXT (Extinction) ve altında 'Ayarlar' sekmesinden ayarlanır Tesadüf 'Gelişmiş' ayarlanır.). Örnek Kupası'nın arta kalan suyu çıkarınd, birlikte (yaklaşık 50 mi) PBS ile aşama 2.2 ya da bir kap içinde, 2.5 den Streptomyces numune 0.1 ml. Emin olun örnek fincan düzgün kapalıdır. Veri toplama başlatmak için 'Al'ı' tıklayın. Saniyede 30-50 olaylar arasında elde akış hızını yönetmek. Akış çok yüksekse, numune fincan PBS ekleyin. Akış hızı çok düşük ise, daha fazla örnek eklemek. En az 2,500 olaylar tık 'DUR' toplandığı zaman. Tüm veri tık 'Store' kaydetmek ve sonraki istatistiksel analiz için dosyayı kaydetmek için. Biosort yazılım sadece. Txt dosyası sonraki analiz için kullanılacak olan, dört dosyaları verileri kaydetmek olacaktır. Bir 50 ml şırınga ve su ile 2 kez yıkama ile örnek kaldırarak bir numune kabı temizleyin. Tüm örnekleri analiz edilinceye kadar tekrarlayın 3,7-3,10 adımları. 4. Veri Analizi . Txt dosyası açın ve (örneğin MS Excel kullanılarak) 25 daha düşük bir EXT ile veri atın. Bu4,12 (Aspergillus niger 150 daha düşük bir EXT tüm veriler atılır) enkaz ve gevşek hifal fragmanları karşılık gelir. '. Txt' Öyleyse, (: Birçok veri dosyaları bu mevcut programlama dili R, otomatik edilebilir bir ovada tek sütunda dosyayı tüm TOFs kaydedin http://www.r-project.org ). Emin SciLab (sürüm 5.3.2 veya daha yeni http://www.scilab.org/ itibaren) bir araya kılavuzda mevcuttur 'fittools' kütüphane, birlikte yüklü olduğundan emin olun: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf Scilab başlatın ve verileri modellemek için fittools kütüphanesinin gerekli fonksiyonları çalıştırın. Kısacası: (sadece bir kez ihtiyaç) kılavuzda gösterildiği gibi fittools kütüphane kurun. Fittools kitaplığı yüklenemedi. Scilab içine verileri ('. Txt' dosyası) okuyun. (Doğal log varsayılan günlük fonksiyonu) verileri dönüştürmek yapın. Veri 2 nüfus modeli Fit. Histogram ve modeli (opsiyonel) ile bir grafik çizilir. Veri (1000 kopya) önyüklemesi. Önyükleyicisini kümeleriyle modeli Fit. Güven 5 parametrelerin tahminlerinin aralıkları olsun. Bu nüfus, bunların 2 aracı (μ 1 ve μ 2) ve beraberindeki standart sapmalar (α 1 ve 2 α) katılımı fraksiyonu (p) hakkında bilgi verecektir. Ayrıca,% 95 güven aralıkları 12,13,15 (1000 kopya) önyükleme sonra modelle takarak belirlenir. Araçlarının güven aralıkları örtüşmeyen ve p güven aralığı 0,025-0,975 arasında olduğunda kümesi Normal dağılımların iki nüfus bir birleşimi olarak açıklanabilir. (Th Notbüyük topakların katılma 1 ise küçük topakların katılımı kısmını p, bir -. p) TOF ve Streptomyces pelet çapı arasındaki ilişki 0,57 x TOF + 159 um 4 eşittir. Durumda iki nüfus üst olarak COPAS parametreleri sıralama olarak kullanımı ortalama TOFs bulunan ve daha sonra küçük ve büyük granül sıralamak bağlı düşük. Diğer sıralama parametreleri kullanıcı taleplerine bağlı olarak seçilebilir unutmayın. 5. Pelet Sıralama Aşama 3.7 açıklandığı gibi dizildi gerekmektedir Streptomyces örnek yükleyin. 'Sınırları sıralanması' Set ve minimal (Lo) ve maksimal (Selam) TOF değerleri hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Alternatif olarak, 'Bölgeler' ve ardından istenilen boyutlarda veya özelliklere sahip granül seçmek için 'Kapı Region Define' seçerek bir alan ayarlayın. 50 ml'lik bir tüpe yerleştirinsıralama parametrelerini karşılamak birden pelet toplamak. Alternatif olarak, bir mikro-titre plaka bireysel peletleri sıralamak için kullanılabilir. Çoklu peletleri (10 4 -10 5) DNA ve protein çıkarımı için ihtiyaç vardır. Tek bir pelet gen ekspresyonunun QPCR analiz için yeterli olmakla birlikte, çok sayıda granül RNA sıralaması için ihtiyaç vardır. Karar verin ve sıralanması gerekiyor pelet sayısını ayarlamak ve seçilen parametreler için sıralamak için 'Sıralama Manuel tıklayın. Pelet miktarı ayarlanır ulaşıldığında, sıralama otomatik olarak sona erer. Numune kabının bir 50 ml şırınga ile numune üzerinde kalan çıkarın ve 2 kez su ile bardak yıkayın. Diğer örnekler kriteri gerekiyorsa tekrarlayın 5,1-5,5 adımları. Kapatmadan önce COPAS kalan peletler bertaraf ve% 70 EtOH ve / veya su içinde% 2 hipoklorit ile bir numune kabı temizlemek için su ile bir numune kabı durulama. Tüm sistemi temizlemek ve su ile bu tekrarlamak klorlu suyun bir örnek çalıştırın. Boş to kabı ve temiz taşma veya Container bulunduğu filtresini değiştirin. Bittiğinde, sistem basıncı serbest bırakmak için 'DUR' tıklayın. Motor durur programı kapatın ve 'tasfiye olmadan Kapat' tıkladığınızda. Ardından bilgisayarı, COPAS, lazer ve pompayı kapatın.

Representative Results

Streptomyces pelet COPAS ölçümleri Streptomisetler boyutlarının geniş bir aralığı vardır sıvı kültürlerde misel topakları oluşturulur. Topak boyutu dağılımının analiz etmek için, bir 2-günlük sıvı yetiştirilen Streptomyces coelicolor kültür, 1 mm meme ile donatılmış bir COPAS Ayrıca Profiler sitometrisi kullanarak, büyük bir tanecik akışa tabi tutuldu. Tipik COPAS çıkışı, Şekil 2A'da görselleştirildiği gibi bir saçılma grafiğidir. X-ekseni topak boyutuna (yani lazer ışını geçirmek için daha büyük topaklar için daha uzun sürer) ile bağlantılı olan, time-of-flight (TOF) temsil eder. Y-ekseni, nesnenin optik yoğunluğunu temsil etmektedir sönme gösterir. Saçılan arsa içinde her bir nokta, lazer ışını geçirerek, tek bir topak, yani, tek bir olaya karşılık gelir. Numune, çok konsantre olduğunda (lazer 100'den fazla etkinlik / saniye algıladığında örneğin) önemlisi, COPAS sıkça bireysel p tespit etmek için başarısızellets. Bu çok yüksek olduğu yanlış TOF değerlerine yol açar. Örneğin seyreltilmesi daha seyreltme artık etkisi TOF yapan bir noktaya kadar, ortalama TOF değerleri azaltır. Yaklaşık 100 pelet / sn analiz edildiğinde bu nokta ulaşılır. Bir histogram içine veri noktaları çizme boyutları normal olarak (Şekil 2B) dağılmamaktadır gösterir. Dağılımı sağa etkiye sahip gibi görünmektedir. Veri setini dönüştüren log da bir normal dağılım (Şekil 2C) yol açmamıştır. Boyut dağılımı, veri matematiksel 12,15 modellenmiştir iki normal dağılımların bir karışımının varsayılarak ile izah edilebilir olup olmadığını değerlendirmek. Modelleme gerçekten de granül boyutu dağılımı, iki farklı popülasyonlarının varlığını varsayarak açıklanabilir olduğunu göstermiştir. Küçük topaklar nüfusu, 248 um arasında bir ortalama boyutu olan topaklar, tüm% 92 meydana geliyordu büyük pel nüfusu(tüm pelet% 8) 319 um'lik bir ortalama boyuta sahip (popülasyonlar katılım fraksiyon% 2,5-97,5 arasında olduğu zaman mevcut olduğu varsayılır unutmayın) sağlar. Büyüklüğüne göre Streptomyces pelet sıralama Büyük ve küçük pelet nüfus mikro-koloniler dizildi. Bu amaçla, iki popülasyonun ortalama tane boyutları sıralama için sınırlarını tanımlamak için kullanılmıştır. 319 um 'den daha büyük topaklar büyük topak popülasyon (Şekil 3) ait olduğu kabul edildi ise, iki boyutta örtüşen kısmından pelet sıralama sınırlamak için 248 um den daha küçük granüller, küçük topak popülasyonundan olarak kabul edildi dağılımlar. Sıralanmış pelet mikroskobik analizi onların farklı boyutlarını (Şekil 3) gösterdi. Toplanan peletler ayrıca DNA, RNA ya da protein izolasyon için kullanılabilir. <img alt = "Şekil 1" fo: src = "/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" ">: İçerik-genişliği fo = "5in" Şekil 1.. COPAS kullanarak Streptomyces pelet ölçmek ve analiz etmek için deney düzeneği şematik. Ayrıntılar için, deneysel prosedürleri bakın. resmi büyütmek için buraya tıklayın. Sıvı-yetiştirilen Streptomyces kültürlerde Şekil 2.. Pelet boyutu heterojen. 2 günlük eski S. COPAS analizi coelicolor yeme kültürü (A) (Uçuş değerlerin Zamanda olarak gösterilen) pelet boyutları normalde dağıtmak olmadığını gösterird (B), ve ne olur bu nedenle zaman log-transforme (C). Bunun yerine, TOF farklı (ve dolayısıyla boyut) pelet iki popülasyonu tespit edildi. resmi büyütmek için buraya tıklayın. Şekil 3,. (Mavi ile gösterilen) 319 um 'den daha büyük bir boyutu olan topaklar büyük topaklar olarak kabul edildi ise ölçülerine uygun Streptomyces pelet Fraksiyonu. Granüller bir boyutu (pembe olarak gösterilmiştir) 248 um den küçük, küçük granül olarak kabul edildi. Mikroskobik inceleme büyüklüğü farkı doğruladı. Bu boyutlar TOF ile d arasındaki ilişkiyi tarif kullanılarak log-transforme edilmiş verilerden hesaplanmıştır unutmayın0.57 × TOF + 159 um eşit bir Streptomyces pelet iameter. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Discussion

Klonal nüfus 6 heterojenite anlayışımıza katkıda tek hücre çok sayıda yüksek hızlı analiz sağladı Flow sitometri. Normal akış sitometri Streptomisetler ve çok hücreli mantar misel peletlerin analizi için uygun değildir. Çalışmalarımız Streptomyces peletler yüksek verimli analiz copas ile mümkün olduğunu göstermiştir. Burada özetlenen prosedürü, basit, hızlı ve son derece tekrarlanabilir. Enstrümanın işlem sırasında akılda tutulması gereken önemli parametre (adım bu protokolün 3.8) 100 olay / sn geçmemelidir akış hızı vardır. Pelet konsantrasyonu ve bu nedenle de akış hızı çok yüksek olursa, gösterge bireysel peletleri tespit etmek için başarısız olduğundan, TOF değerleri yanlış hesap edilir. Yeterince PBS eklenmesi ile örnek seyreltilmesi bu sorunun üstesinden gelmektedir.

Sınırlamalar
COPAS Artı kullanımı d buradan 30-700 um arasında değişen bir boyuta sahip parçacıkları ölçmek için uygun olan 1 mm, bir meme çapı vardır. Bu nedenle, meme Streptomisetler tarafından oluşturulan peletler ölçüm sağlar. Filamentöz mantarların durumunda mikro koloniler COPAS Plus genel uygulanabilirliğe sınırlayan, daha büyük olabilir. COPAS XL boyutu 1.500 um kadar parçacıkları ölçmek ancak çaplı alt bölgesindeki duyarlılık COPAS Plus ile karşılaştırıldığında daha azdır. COPAS Plus ve COPAS XL Hem 30 mikron daha küçük parçacıkları analiz edemezsiniz. Bu bireysel mikrobik sporlar veya hücreleri analiz edilemez anlamına gelir. Buna ek olarak, COPAS doğru sporlar ve hücreler ya da çok küçük mikro kolonilerin küçük agregalar analiz olmayabilir. Bunun için, normal cep analiz kullanılmalıdır. Bu sınırlama, 1-1,500 mikron aralığında partikül analiz Union Biometrica en Biosorter tarafından yenilmektedir. Satın alma ödül Ancak yüksektir.

t "> Sorun Giderme
COPAS kullanımı kolay sağlam bir araçtır. Ancak, bazen peletler numune fincan içine, bir örnek yükleme ve ölçüm sonrasında başlangıç ​​algılanmaz. Nedeni genellikle kolayca 'temiz' komutu basılarak çözülebilir bir tıkanmış giriş tüp vardır. Bu, numune fincan içine geri boru sistemi pelet zorlar. Alternatif bir sebep kapak düzgün numune kabının üzerinde yer olmadığını olabilir. Bu basınç kaybı ve pelet tespit etmek için birlikte neden olmaktadır.

Önemi ve gelecekteki yönelimler
Biz burada topak büyüklüğüne analizine odaklanmış ama COPAS kurulum da analiz edebilmek ve çeşit floresan ve yoğunluğuna dayanır. Floresan algılama GFP gibi gazetecilere dayalı gen ifadesini analiz için bize sağlar. Bundan başka, hücrelerin bileşim değerlendirilebilir. Daha güçlü Bu parametreler göre pelet ayırmak için seçenekçözücüleri. Kriteri topaklar her omik çalışmaları dahil olmak üzere alt analizi için kullanılabilir. Nitekim, daha önce 60.000 büyük ve 200.000 küçük granül sıralanır ve proteom büyük ve küçük saçmalar 4 arasında anlamlı derecede farklı olduğunu göstermiştir. Bu teknoloji, bu nedenle hücre fabrikalarında olarak Streptomycet'ler geliştirmek için yeni yol sağlar.

COPAS teknolojisinin önemli yararı zaman. Hücre peletleri ile ilgili daha önceki çalışmalarda mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve bu birkaç yüz 16 kadar analiz edilebilir pelet sayısını sınırlar edilmiştir. Mikroskopi çalışmalar zaten sıvı yetiştirilen Streptomyces kültürleri 16 pelet iki nüfus varlığını göstermiştir. Gerçekten de, pelet iki popülasyonu farklı Streptomisetler 4, çok sayıda bağımsız olarak kültür koşulları tespit edildi. Bu boyut heterojenlik ipliksi Streptomisetler ile sınırlı değildir, aynı zamanda lifli mantar 12 gözlenmiştir </ Sup>. Tüm durumlarda, heterojenite altında yatan mekanizmalar henüz bilinmemektedir. Pelet sıralamak olasılığı büyüklüğü ve floresan göre bu tür mekanizmalar çözülmeye bize sağlar.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Materials

Copas PLUS Union Biometrica PLUS Large particle flow cytometer including lasers and software
NaCl Sigma Aldrich S3014 PBS component
KCl Sigma Aldrich P9541 PBS component
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 PBS component
KH2PO4 Sigma Aldrich P9791 PBS component
Difco Yeast Extract BD Biosciences 210933 Media component
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 Media component
Oxoid Malt Extract Fisher Scientific OXLP0039B Media component
Glucose Sigma Aldrich G8270 Media component
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Media component
MgCl2.6H2O Sigma Aldrich M2670 Media components. Add after autoclaving.
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775 Fixation of pellets
Sodium Hypochlorite Solution  Sigma Aldrich 71696 For cleaning of the instrument
EtOH VWR 20816.367 For cleaning of the instrument
Erlenmeyer Flask (250 ml) Fisher Scientific 214-1132 Culture flask for growing Streptomyces
Springs Verenfabriek De Spiraal Custom-Made Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm
Sterile Centrifuge Tube (15 ml) Sarstedt 62.554.002
Syringes (50 ml) Sigma Z683698 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hopwood, D. A. . Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).
  2. van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
  3. Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
  4. van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
  5. Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  6. Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
  7. Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
  8. Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
  9. Pulak, R., Strange, K. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).
  10. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetica. 175, 1505-1531 (2007).
  11. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  12. de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
  13. van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
  14. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. . Practical Streptomyces Genetics. , (2000).
  15. Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
  16. Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).

Tags

StreptomycesCell PelletsComplex Object Parametric Analyzer And Sorter (COPAS)Mycelial PelletsPellet SizeCell FactoryBioreactorFilamentous BacteriaEnzyme ProductionAntibiotic ProductionHeterogeneous GrowthProductivity

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Petrus, M. L. C., van Veluw, G. J., Wösten, H. A. B., Claessen, D. Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter. J. Vis. Exp. (84), e51178, doi:10.3791/51178 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image