の仕分け<em>ストレプトミセス</em複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーターの使用>細胞ペレット

2日齢の液体増殖させた培養物からのペレットを分析し、ソートストレプトマイセスするための手順を模式的に図1に示されている。方法の詳細は以下の通りである。 1。 （メディアとバッファの作成を含む）の成長 （; pH7.4に調整し、蒸留水1Lに80グラムのNaCl、2mMのKCl、14.4グラムのNa 2 HPO 4、2.4グラムのKH 2 PO 4 PBS）10×リン酸緩衝生理食塩水を1リットル調製する。使用時にPBSを1 Lを得るために、蒸留水900ミリリットルに10倍のPBS 100ミリリットルを追加。 YEME培地1L（3グラムDifco酵母エキス、5グラムバクトペプトン、3グラムオキソイド麦芽エキス、10グラムのブドウ糖、340グラムのスクロース、1Lの蒸留水まで）および2.5MのMgCl 2を 100ミリリットルを用意します。オートクレーブで両方のソリューションを殺菌。また、他のストレプトミセスメディアは4,14を使用することができることに注意してください。 に100ミリリットルYEME培地および0.2ミリリットルの2.5MのMgCl 2を追加します。無菌250ミリリットルの三角フラスコは、金属コイルばねを装備。勉強する細菌サンプルと同じ数のフラスコを準備します。 10 6胞子/ mlの胞子濃度を得るために、 ストレプトマイセス 10 8胞子を各フラスコに接種する。 180rpmで振盪しながら30℃で2日間細菌を成長させる。 2。サンプリング無菌5ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルファルコンチューブに各培養物から5ミリリットルのサンプルを転送します。サンプル全体の文化を代表することを確実にするためにサンプルを採取しながら、ゆっくりと文化を振る。 サンプルはCOPASで直ちに分析されたら、[いいえサンプル調製手順は必要ありません。氷の上にサンプルを保持し、このプロトコルの3.1に進みます。サンプルは、後の時点で分析すると、このプロトコルの工程2.3-2.5に記載されるようにペレットを修正する。適切analys後に洗浄しない場合にも、固定管系における細菌の増殖を阻止することに注意してくださいES。ホルムアルデヒドとの固定は、下流分析を妨げていないことを確認してください。例えば、RNAをホルムアルデヒドで固定した後、真菌のペレットから分離することができませんでした。対照的に、RNAが正常の70％エタノールで固定した12後に単離した。 試料5mlに37％ホルムアルデヒド600μLを加え、チューブ3回転倒混和。 30分間氷上でサンプルを修正します。 遠心分離機10分間4℃で固定ローターで2500×gでのサンプル。慎重に上清を除去し、PBS 5mlでペレットを洗う。 ペレットをPBS 2Xで洗浄されるように、ステップ2.4​​を繰り返します。試料は、数週間、4℃でPBS中に保存することができる。 3。 COPAS分析 COPASプラス、ポンプ、コンピュータおよび488nmのアルゴンレーザーがオンになってBiosortソフトウェアを起動していることを確認します。オンが、レーザーは、まだスタンバイモデュスになります。 シース液ボトルがいっぱいでないか確認してください廃液ボトルが空になっています。 上にスタンバイから488 nmのアルゴンレーザーを切り替えて「開始」を押した後に「RUN」をクリックします。レーザーがオンのときにしてから約60秒で、[完了]をクリックします。 圧力計を確認してください。 「シース」のための圧力は、「サンプル」、「ソーター」と「​​クリーン」は、それぞれの周りに4.0、0.5、2.7、および10.9をお読みください。 次の「圧力OK」のチェックボックスをクリックします。次に、システムは、フローセルをプライミングし、使用する準備ができている。 標準設定は11で、「遅延」と「幅」7と想定されます。しきい値は、飛行時間を表すTOFで、「TOF最小 'の'信号 'の50と40に設定されている。 （完全を期すために：すべての '利益'が1に設定され、トリガが2.50 MHzのが選択されている「スキャンレートを選択して「下のEXT（絶滅）にし、「構成」タブで設定されている一致が「強化」に設定されています）。 サンプルカップのANから残った水を除去D（50ミリリットル程度）のPBSと一緒にカップにステップ2.2または2.5からのストレプトマイセス·サンプルの0.1ミリリットルを追加。サンプルカップが適切に閉じられていることを確認します。 データの収集を開始するには、[取得]をクリックします。毎秒30〜50のイベントの間で取得するために流速を管理します。流量が高すぎる場合、試料カップにPBSを追加する。流速が低すぎる場合、より多くのサンプルを追加する。 少なくとも2500のイベントは、クリック 'stop'を収集しているとき。すべてのデータを保存するには、「ストア」をクリックして、その後の統計分析のためのあなたのファイルを保存します。 Biosortソフトウェアは、。txtファイルは、その後の分析に使用される、そのうちの4つのファイル内のデータを保存します。 50ミリリットルの注射器と水2Xで洗浄してサンプルを除去することにより、試料カップを清掃してください。 すべてのサンプルが分析されるまで繰り返して3.7から3.10を繰り返します。 4。データ解析 txtファイルを開いて、（例えば、MS Excel用を使用して）25よりも低く、EXTを使用してデータを破棄します。この4,12（ アスペルギルスニガーのために150よりも低く、EXTとすべてのデータが破棄される）破片とゆるい菌糸断片に対応しています。その後、平野'。TXT」ファイルに1列のすべてのTOFを保存（：多くのデータのためには、これはから入手できるプログラミング言語R、自動化することができるファイルhttp://www.r-project.org ）。 あるSciLab（http://www.scilab.org/からバージョン5.3.2以降）が、一緒に説明書と、提供されています 'fittools」ライブラリと共にインストールさからのものであることを確認してください。 http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual％20fittools.pdf あるSciLabを起動し、データをモデル化するためにfittoolsライブラリの必要な機能を実行します。要するに：（一度だけ必要とされる）取扱説明書に示されているようfittoolsライブラリをインストールします。 fittoolsライブラリをロードします。 あるSciLabにデータ（ '。TXT」ファイル）をお読みください。 （自然対数は、デフォルトのログ機能である）データを変換ログインします。 データへの2集団のモデルに適合。 ヒストグラムとモデル（オプション）とのグラフをプロットします。 データ（千回の反復）のブートストラップ。 ブートストラップデータセットにモデルを当てはめる。 5パラメータの推定値の間隔の信頼を得る。これは集団の参加率（P）については、その2手段（μ1、μ2）および添付の標準偏差（α1とα2）を提供します。さらに、95％信頼区間（千回の反復）12,13,15をブートストラップした後にモデルと再装着によって決定されます。平均の信頼区間が重複しないとpの信頼区間は0.025から0.975の間にある場合、データセットは正規分布の二つの集団の組み合わせとして説明することができる。 （TH注大型ペレットの参加は1であるのに対し、小さなペレットの参加割合で、Pである- P）TOFおよびストレプトマイセス·ペレットの直径との関係は、0.57×TOF + 159ミクロン4に等しい。 場合、2つの集団は、平均のTOFはその後、大小のペレットを並べ替えるには上限と下限としてCOPASのパラメータを並べ替えるなどの用途が見出されている。また、他の仕分けパラメーターは、ユーザーの要求に応じて選択することができることに留意されたい。 5。ペレット選別ステップ3.7で説明したようにソートする必要があるストレプトミセス·サンプルをロードします。 「制限のソート」に設定し、最小限の（LO）および最大（HI）のTOF値についての詳細を提供します。別の方法として、「地域」を押した後に所望の寸法や特性を持つペレットを選択するために「ゲート領域を規定する」を選択することで、領域を設定。 50 mlチューブをソートパラメータを満たす複数のペレットを収集します。あるいは、マイクロタイタープレートは、個々のペレットをソートするために使用することができる。複数のペレット（10 4〜10 5）を、DNAおよびタンパク質抽出のために必要とされる。単一のペレットは、遺伝子発現のqPCR分析のために十分であるが、複数のペレットをRNA配列決定のために必要とされる。 ソートされ、選択したパラメータのためにソートする並べ替え手動」をクリックする必要のあるペレットの数を決定し、設定します。ペレットの設定量に達すると、自動的にソートが終了する。 サンプルカップから50ミリリットルのシリンジでサンプル上左を取り外し、水2Xでカップを洗う。他のサンプルをソートする必要がある場合は、繰り返して5.1から5.5を繰り返します。 COPASをシャットダウンする前に、残りのペレットを除去し、70％EtOHでサンプルカップおよび/または水中の2％の次亜塩素酸をきれいに水でサンプルカップをすすいでください。システム全体をきれいにし、水でこれを繰り返すように塩素水のサンプルを実行します。空トン彼は、コンテナとクリーンをオーバーフローするか、このコンテナ内に存在するフィルターを交換してください。 終了したら、システムからの圧力を解放するために「停止」をクリックします。モータが停止してプログラムを閉じて、「パージせずにシャットダウン」をクリックする。その後、コンピュータ、COPAS、レーザー、ポンプのスイッチを切る。