可视化的活细菌细胞蛋白-DNA相互作用使用光活化的单分子跟踪

1。细胞培养使用无菌培养管和移液器吸头。 大肠杆菌大肠杆菌菌株AB1157 POLA-PAmCherry携带POL 1的C-末端PAmCherry融合。融合通过使用λ-Red重组作为Datsenko 等人取代野生型基因插入到本机的染色体位置。融合蛋白的8功能性被证实作为判断细胞的生长速率和灵敏度的DNA损伤剂甲基磺酸甲酯（MMS）。在建筑的细胞株的更多信息可在Uphoff 等人 7可以发现，Datsenko 等人，8，和 雷耶斯-拉莫思等 9细胞培养物生长在M9基本培养基中，以减少自发荧光和避免对显微镜载片上的背景颗粒。可选地，一种营养丰富的确定的培养基中可使用10。 连胜大肠杆菌大肠杆菌菌株AB1157 POLA-PAmCherry从一个卢里亚肉汤（LB）琼脂板选择性抗生素（在这里，25微克/毫升卡那霉素）冷冻甘油和孵化在37℃过夜。 从单细胞集落接种5ml的LB培养和生长，在37℃下振荡以220rpm搅拌3小时。 稀释培养1:10,000到5ml基本培养基（M9培养基，MEM氨基酸+脯氨酸，MEM维生素，0.2％甘油）中并在37℃下振荡以220rpm过夜。 第二天早晨，用分光光度计测定光密度（OD），并稀释的培养在5毫升的新鲜最小培养基至OD 0.025。生长2小时，在37℃以220rpm振荡早期指数生长期（OD值0.1）。 集中1毫升细胞在1.5ml微量离心管中离心2300×g离心5分钟。去除上清，重悬细胞沉淀在20微升残留培养基中，振荡。 2。显微镜幻灯片Preparat离子准备在DH 2 O 1.5％的低荧光琼脂糖溶液使用微波炉融化琼脂糖直至溶液澄清。通过轻轻地上下吹打几次混匀500μl的熔化的琼脂糖溶液与500μl的2×基础培养基中。 均匀地涂抹在琼脂糖溶液在显微镜盖玻片（否1.5厚）的中心。这必须尽快进行琼脂糖冷却之前，避免气泡。 压平垫与第二盖玻片（否1.5厚度）。以消除背景荧光颗粒，盖玻片预先在炉中燃烧，在500℃下进行1小时。烧盖玻片可保存周在室温下以铝箔覆盖。 对于DNA损伤的实验中，制备含100毫米彩信琼脂糖垫。按照程序步骤2.1-2.3，但增加了8.3微升彩信到500微升M9培养基中，用500μl融化的1.5％琼脂糖混合之前，为100毫米的终浓度MS。 （ 注意！MMS是有毒和致突变，且必须带手套，口罩，护目镜，以及白大褂处理）。 从垫取下顶部的幻灯片，并添加1微升的浓细胞悬液到垫。通过覆盖垫未使用的烧盖玻片（否1.5厚度，搭配显微镜物镜规范）并按下轻轻地在投影片上的固定化细胞。细胞应在固定的45分钟的琼脂糖凝胶垫干之前进行成像。为了防止在较长的干燥实验，琼脂糖垫可以使用硅密封垫密封。 对于DNA损伤的实验中，培养细胞固定在含100毫米彩信20分钟，在湿润的容器中，在室温下成像前的琼脂糖凝胶垫。 3。准备显微镜数据采集 PALM依赖于检测单个荧光蛋白的精确定位。的敏感性和最佳比对该显微镜是用于数据质量的关键。单分子荧光显微镜通常采用全内反射（TIR）照明通过在薄款盖玻片表面上令人兴奋的只有荧光增强信号噪声比。在这里，成像大肠杆菌内大肠杆菌需要高度倾斜的照明11，它可以在一个TIRF显微镜通过略微降低激发光的角度来实现。 PAmCherry成像更需要一个405 nm的光激活激光和561 nm激发激光。荧光发射被记录在一个电子时产生的114.5毫微米/像素的像素长度的倍率乘以CCD（EMCCD）相机。为了获得最佳的定位精度，像素大小应约匹配的PSF的标准差宽度，以确保充足的采样无需在信号过太多的像素蔓延。 图3显示了一个最小的PALM设置的示意图。 电影1给人的定制显微镜建设进程的印象，见Uphoff 等[7]对仪器的详细说明。 执行常规显微镜对准。测量405 nm和561 nm的连续波激光强度的目标面前。调整561 nm的强度3.5毫瓦（〜400瓦/厘米2）和405 nm的强度10μW（〜1瓦/厘米2）。使用连续可变中性密度滤光片轮，允许从0-10微瓦405 nm的强度逐步调整。关掉激光照射，直到试验开始。 将样品在显微镜舞台上，并把细胞变成焦点在透射光显微镜模式（ 图4A）。该EMCCD相机增益已被关闭，以防止损坏相机通过曝光过度。 定义一个裁剪视野，以减少数据大小和增加相机读出速度。 覆盖了从环境光线和SWIT样本通道上的EMCCD相机增益。 帧速率设定为15.26毫秒/帧（包括0.26毫秒相机读出时间）。看到在讨论部分“曝光时间和强度的激励”。 显示相机的数据来检查深色背景信号（ 图4B）。 开关561 nm激光，并检查激励背景信号（ 图4C）。 开关405 nm激光上的POL 1-PAmCherry融合蛋白的光敏化和增加强度，直到荧光的PSF出现。 调整激发光束的角度来照射样品接近盖玻片表面的仅一个薄截面。 为此，激光束被聚焦成一个100X NA 1.4物镜的后焦面（ 图3）。平移所述聚焦透镜垂直于光束移动焦点远离物镜使光束以退出下一个角度的目标的中心。 嗳米最大化的荧光强度并减少背景信号。需要注意的是严格的TIR激励是最优的内盖玻片表面的100nm的荧光图像，但是，成像DNA结合蛋白与大肠杆菌相关大肠杆菌类核需要更深层次的照明可达0.8微米。 4。数据采集在这里，我们描述的一般协议收购PALM电影。同样的程序适用于成像POL 1-PAmCherry融合蛋白在大肠杆菌完好大肠杆菌细胞在连续的DNA损伤的治疗与彩信。该方法对每个小区不同分子量或拷贝数的融合蛋白的应用将需要不同的采集设置（见讨论部分）。 找到了一个全新的领域细胞在透射光显微镜模式（FOV）和聚焦影像。拿相机的快照记录细胞轮廓（ 图4A）。从环境光线覆盖样品并开启EMCCD相机增益。 开关561 nm激光，并漂白盖玻片上的细胞自发荧光和背景点为开始数据采集前几秒钟。对于细胞生长和成像中的M9培养基中，并用盖玻片烧通常有很少的荧光背景，但是，预漂白可能是在富生长培养基如LB成像的细胞是有用的。需要注意的是强烈的照明是有毒的细胞，使预漂白应保持在最低限度。 开始连续561 nm激发下的收购PALM电影在15.26毫秒/帧。 开关405 nm激光，并逐渐增加强度过电影的过程中，达到了高达1瓦/厘米2。避免会引起细胞自体荧光高405 nm的强度。要注意的荧光分子的密度 – 以保持低的激活率是很重要的，这样的PSF是清楚分离出的每个帧（ 图4D-F）。 记录万帧/电影（取决于分子的每个单元将被成像的数量）;一个电影通常需要2-3分钟，并且需要0.5-1 GB的硬盘空间取决于视场的大小。 重复采集程序的多个视场。请注意，每个视场只能使用一次成像，因为PAmCherry荧光基团得到的光活化漂白和不可逆的。 5。数据分析一种自动化的和可靠的数据分析框架是用于该方法的性能和效率的关键。我们使用MATLAB编写的定制软件。 使用克罗克等 12描述的算法执行定位分析，霍顿等人 13，HoldenI 等人 14，和维塞尔等人 15的PSF，首先在带通滤波后的图像使用高斯核7像素确定s管径（ 图5A）。候选位置对应的PSF与峰值像素强度高于背景的信号（ 图5B）的4.5倍的标准偏差。每个候选PSF的局部亮的像素用作用于拟合的椭圆高斯函数（ 图5C）的初始猜测。自由拟合参数为：x位置，y位置，X宽度，y轴的宽度，旋转角度，幅度和背景抵消。椭圆高斯掩模时的曝光时间，从而模糊和变形的PSF占分子。 从PALM电影到同一视场的透射光显微镜图像的所有帧画出所得的（X，Y）的本地化。 POL 1-PAmCherry的本地化应该出现E的中心区域内大肠杆菌细胞（ 图6A）。如果许多本地化出现细胞外，定位阈值被设置得太低，或者样品包含背景荧光发色粒子。 对于自动跟踪分析，MATLAB实现的克罗克等描述的算法的人 12可以使用（见讨论部分“扩散分析”）。出现在随后的帧中的用户定义的跟踪窗口的位置是连接形成一个轨迹。在多个本地化发生在同一个窗口的情况下，磁迹是唯一分配通过最小化步长的总和。对于这些不同的因素的详细讨论，从单粒子跟踪数据计算的扩散系数时，看到维塞尔等人 15 该算法使用一个内存参数，以占轨道在瞬态闪烁或错过了本地化。这里，我们设置内存参数设置为1帧，较高的值可用于跟踪的荧光团与长寿命的暗状态。 选择基于以下的校准步骤的合适的跟踪窗口。对于POL 1，我们使用0.57微米（5个像素）。运行跟踪算法的一系列跟踪窗参数。计算每个小区测量的轨道作为跟踪窗口，以确定可能的最小跟踪窗口，不分裂的轨道（ 图6B）的函数的数量。 积相同的视场的透射光显微镜图像上得到的磁迹进行可视化的细胞内分子运动的空间分布。 POL1曲目应显示扩散的单细胞（ 图6C-D）内局限。 如果磁道的一小部分出现细胞间跨越这表明单独的分子被错误地相连，因为跟踪窗口被选择过大和/或光活化率过高（ 图6E）。 画出连续的本地化（ 图6F）之间的步长的累积分布。该曲线上升和饱和顺利进行足够大的跟踪窗口但显示了一个隔流板边缘，如果窗口被选择过小。 分析POL1的扩散特性，计算均方位移（MSD）连续的本地化为每个轨道之间有一个总的N个步骤）： MSD = 1 /（N-1）ΣI = 1，N-1 （X I +1 – X I）2 +（Y i +1的 – Y I）2。 仅包括具有至少4个步骤（N≥5的本地化）跟踪，以减少在MSD值的统计不确定性。 剧情MSD值的曲线比通过计算位移在多个帧（ 图6G）一系列的滞后时间。 MSD的曲线的形状可有助于所观察到的分子运动（ 图6H）进行分类。 计算每磁道从MSD中的表观扩散系数D *： D * = MSD /（4ΔT） – σ 地名 2 /ΔT。 第二TERM校正估计的定位误差（这里，σLOC = 40纳米并且Δt= 15.26毫秒，看到维塞尔等人 15）。 从视场（ 图7A）所有曲目绘制测量D *值的直方图。 确定出现势必会根据每个轨道测量D *值的染色体个体POL1分子。分开绑定的人口（锐配电中心在深*〜0 2微米/秒）和自由扩散的分子（广泛分布集中在深* 0.9〜2微米/秒），通过设置一个阈值D * <0.15μm的2 /秒（红柱图7A和7D）。 进行定位，跟踪，并在未损坏的细胞（ 图7A-C）和下DNA损伤的治疗与彩信（ 图7D-E）细胞扩散分析POL 1。结合轨道的部分提供了DN的直接定量测量POL 1 在体内的修复活动。