تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة
Summary
Photoactivated المجهر التعريب (النخيل) جنبا إلى جنب مع تتبع جزيء واحد يسمح الملاحظة المباشرة والكمي للتفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا القولونية الحية.
Abstract
تفاعلات الحمض النووي البروتين هي في قلب العديد من العمليات الخلوية الأساسية. على سبيل المثال، تخضع تكرار الحمض النووي، والنسخ، والإصلاح، وتنظيم كروموسوم من البروتينات الحمض النووي ملزم بأن تعترف هياكل الحمض النووي محددة أو تسلسل. ساعدت في المختبر تجارب لتوليد نماذج مفصلة عن وظيفة العديد من أنواع البروتينات الحمض النووي ملزم، ولكن ، والآليات الدقيقة لهذه العمليات وتنظيمها في بيئة معقدة من الخلايا الحية تظل أقل بكثير من المفهوم. قدمنا مؤخرا طريقة لقياس أنشطة إصلاح الحمض النووي في الخلايا القولونية الحية باستخدام Photoactivated توطين مجهرية (النخيل) جنبا إلى جنب مع تتبع جزيء واحد. ويحدد لنا النهج العام الأحداث الحمض النووي ملزم الفردية عن طريق التغيير في التنقل من بروتين واحد على ارتباط مع الصبغي. جزء من جزيئات منضم يوفر مقياس كمي المباشر للفعل البروتينivity وفرة من ركائز أو مواقع الربط على مستوى خلية واحدة. هنا، نحن تصف مفهوم الأسلوب وإظهار إعداد العينات، والحصول على البيانات، وإجراءات تحليل البيانات.
Introduction
يصف هذا البروتوكول في القياس المباشر للتفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا الحية القولونية. تقنية تستخدم التغيير في معامل الانتشار من بروتين واحد fluorescently المسمى لأنه يربط كروموسوم (الشكل 1). للتدليل على أسلوب ونحن نستخدم الحمض النووي بوليميريز الأول (Pol1)، وهو بروتين الحمض النووي ملزم تنميط الذي يملأ الفجوات في النسخ المتماثل الحمض النووي حبلا متخلفة ومسارات إصلاح الختان 1.
ظهور فائقة الدقة مضان المجهري تمكن التصور من الهياكل الجزيئية في الخلايا مع قرار نانومتر. Photoactivated توطين مجهرية (النخيل) توظف البروتينات الفلورية التي يمكن تفعيلها من حالة الظلام الأولية إلى حالة الفلورسنت (الشكل 2). فقط يتم تنشيط مجموعة فرعية من جميع الجزيئات المسمى في أي وقت لتحديد مواقفهم بطريقة متسلسلة، بصرف النظر عن ركان مجموع تركيز الجزيئات المسمى في العينة 2. الدقة في الترجمة جزيء يعتمد بشكل رئيسي على حجم الفلورسنت وظيفة نقطة انتشار (قوات الأمن الفلسطينية)، وعدد من الفوتونات التي تم جمعها، وإشارة الخلفية 3. تركز العديد من التطبيقات لهذه الطريقة على تحسين التصور من الهياكل الخلوية. إدراك أن النخيل يمكن دمجها مع واحدة جزيء تتبع 4 فتحت آفاقا جديدة لمتابعة مباشرة لحركة الأرقام التعسفي من البروتينات وصفت في الخلايا الحية. زيادة الحساسية والقرار الزماني من المجاهر مضان الآن تسمح تتبع واحد نشرها البروتينات الفلورية في السيتوبلازم البكتيري 5.
هنا، ونحن توظيف PAmCherry، وهو بروتين فلوري هندسيا الذي يحول بشكل لا رجعة فيه من حالة nonfluorescent الأولية إلى حالة الفلورية على التشعيع مع 405 نانومتر ضوء 6. يمكن fluorophores PAmCherry تفعيلها تكون الصورةد بواسطة الإثارة في 561 نانومتر، وتعقب لعدة إطارات حتى photobleaching من. علينا أن نظهر قدرة طريقة لتحديد الأحداث الحمض النووي ملزم عابرة للبروتينات واحدة باستخدام مزيج من Pol1 وPAmCherry. علاج الخلايا مع methanesulfonate الميثيل (MMS) يسبب الضرر DNA مثيلة التي تحولت إلى ركائز الحمض النووي شق من الانزيمات إصلاح قاعدة الختان. يظهر لدينا وسيلة واضحة ملزمة للجزيئات Pol1 واحد ردا على الضرر MMS 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
نناقش العديد من الاعتبارات الرئيسية لنجاح التجربة.
الاختيار والتعبير عن بروتين فلوري الانصهار: هناك لوحة كبيرة من البروتينات الفلورية photoactivatable وphotoswitchable 17. الخيار محدد يعتمد على خصائص المجهر، وخاصة أجهزة الليزر والفلاتر المتاحة. الجمع بين 405 نانومتر و 561 نانومتر هو المثل الأعلى للالبروتينات الفلورية photoactivatable المشتركة. اخترنا PAmCherry 6 لأنه لم تظهر أي أحادى والتجميع في الخلايا. علاوة على ذلك، لا رجعة فيه تنشيط ضوئي يسمح إحصاء عدد fluorophores تفعيلها لقياس أعداد نسخة البروتين في الخلية. بدلا من التعبير عن البروتين الانصهار من البلازميد، ونحن نفضل الإدراج الكروموسومات من ترميز الجين للبروتين الانصهار في البرية من نوع مكان. وهذا يضمن استبدال كامل للبروتين في المصالح مع الفلورسنت هاءrsion والحفاظ على النوع البري مستوى التعبير.
معدل تنشيط ضوئي: من المهم لضبط معدل تنشيط ضوئي بحيث جزيء في المتوسط أقل من واحد لكل خلية في حالة الفلورسنت في أي إطار من الفيلم. هذا يعتمد على كثافة 405 نانومتر، وغادر عدد من الجزيئات ليتم تفعيلها. بكثافات التصوير منخفضة جدا، ومع ذلك، سيتم تصويرها ليس كل جزيئات قبل نهاية الفيلم أو الأفلام الطويلة جدا لا بد من الحصول عليها. عدد الإطارات المسجلة في الفيلم يعتمد على عدد نسخة من البروتينات الانصهار لكل خلية ومتوسط photobleaching من عمر PAmCherry في ظروف الإثارة المستخدمة. عدد نسخة من Pol1 هو ~ كان 400 الجزيئات / خلية 1 والقيمة المتوسطة للتوزيع الأسي photobleaching من العمر ~ 4 إطارات. عن طريق زيادة كثافة تدريجيا 405 نانومتر، وتوزع بالتساوي على تفعيل الأطر 10،000 من الفيلم. لذلك، كل خلية هو OCCUPالعبوات الناسفة بواسطة جزيئات الفلورسنت لما مجموعه 1،600 ~ الإطارات، وضمان تداخل قليلا من PSFS ومضاعفات تتبع في فيلم من 10،000 الإطارات.
وقت التعرض والإثارة شدة: قبل كل شيء، وأوقات التعرض بحاجة إلى أن تكون قصيرة بما فيه الكفاية لمراقبة PSFS حادة مع الحركة قليلا وضوح. ومع ذلك، ينبغي اختيار معدل الإطار لانتاج الحركة الجزيئية يمكن ملاحظتها بين الإطارات المتعاقبة وراء عدم اليقين التعريب، وإلا تضيع الفوتونات حاسمة من قبل الإفراط المسار. يجب أخذ عينات من حركة الجزيئات غير منضم في فترات زمنية طويلة بما فيه الكفاية لتكون مميزة بوضوح من الحركة واضح من جزيئات ملزمة نظرا لعدم اليقين التعريب. عندما يتم تعيين وقت التعرض، ويجب أن تعدل شدة قوات الأمن الفلسطينية. دقة الترجمة من قوات الأمن الفلسطينية يزيد مع عدد من الفوتونات الكشف خلال مدة إطار. شدة الإثارة أعلى زيادة معدل بو الفوتونر أيضا معدل photobleaching من وإشارة الخلفية. استخدام أقل شدة الإثارة التي تعطي دقة التعريب المطلوب. لPol1-PAmCherry اخترنا 15.26 مللي ثانية / الإطار و 3.5 ميغاواط 561 نانومتر الإثارة (400 واط / سم 2). من المهم لتأكيد بقاء الخلية لظروف التصوير خاصة من خلال رصد نمو الخلايا والتشكل قبل وبعد الحصول على البيانات (انظر معلومات تكميلية في أبهوف وآخرون. 7).
Pol1 يسلك وقت ملزم لل~ 2 ثانية إلى ركيزة الحمض النووي في الجسم الحي شق 7، وبالتالي فإننا نتوقع أن غالبية الجزيئات إما أن يكون في الدولة منضم أو غير منضم لمدة كاملة من مسار. جزيئات ملزمة تظهر متحركة أساسا لمواقع كروموسوم لها معامل الانتشار عدة أوامر من حجم أقل (~ 10 -5 2 ميكرون / ثانية، إلمور وآخرون 18) من Pol1 نشرها في السيتوبلازم (~ 1 ميكرون 2 </sتصل> / ثانية).
تحليل نشر: يتم حساب معامل الانتشار D واضح * من MSD من المسارات الفردية، بمعدل متوسط أعلى من الحد الأدنى من 4 خطوات (5 إطارات) لتقليل الخطأ الإحصائي. نلاحظ أن ~ 75٪ من جزيئات التبييض في غضون اقل من 5 إطارات لظروف التصوير وصفها. هذه المسارات القصيرة لا توفر اليقين إحصائية كافية لتمييز جزيئات منضم وغير منضم. ومع ذلك، فإن الكسور النسبية للجزيئات منضم وغير منضم أن يقدم تقريرا عن نشاط البروتين تكون مستقلة عن عدد من المسارات تحليلها.
ومن المفيد لحساب الخطأ PSF التعريب (σ الموضع) في حساب D * لأن عدم اليقين يضيف خطوة عشوائية واضحة لتوطين كل جزيء 15.
لتحسين تصنيف الجزيئات مقيدة ونشرها، نوصي حساب D * بوتح من التشريد خطوة واحدة وتشريد أكثر من مرة من إطارين. فمن الممكن بعد ذلك إلى تعيين اثنين منفصلة D عتبات *: D * (15 ميللي ثانية) <0.15 ميكرومتر 2 / ثانية وD * (30 ميللي ثانية) <0.075 ميكرون 2 / ثانية.
لاحظ أن D * هو معامل الانتشار الواضح أن يتأثر الحبس خلية من المسارات وعدم وضوح الحركة بسبب نشرها خلال فترة التعرض. لاستخراج دقيق معاملات نشر متحيز، وقد ثبت أنه من المفيد أن نقارن الحركة لاحظ أن البيانات محاكاة بناء على مؤشر ستوكاستيك البراونية نموذج الحركة 5،7. ويمكن أيضا أن تستخدم البيانات محاكاة لاختبار إجراءات تحليل البيانات.
التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة: نحن وصف نهج عام لتصور وقياس التفاعلات الحمض النووي البروتين في الجسم الحي بواسطة التغيير في التنقل من البروتين على ملزما للكروموسوم. أنشطة الحمض النووي أوالبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي المشاركة في إصلاح، والنسخ، والنسخ، وصيانة كروموسوم بالتالي يمكن اتباعها في الوقت الحقيقي على مستوى خلية واحدة مع دقة مكانية أقل من الحد الحيود الضوئية. Photoactivated تتبع جزيء واحد يمتد أساليب تتبع التقليدية التي تقتصر على عدد قليل من الجزيئات المسماة لكل خلية. طريقة بديلة الذي يقيس الانتشار الجزيئي في الجسم الحي هو الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP). في حين FRAP مفيد جدا لقياس خصائص الانتشار العالمي في الخلايا الكبيرة، هي محدودة في قدرتها على حل العديد من الأنواع الجزيئية مع التنقلات المختلفة في بيئة غير متجانسة مكانيا، وخاصة بالنسبة للخلايا البكتيرية الصغيرة.
لقد طبقنا photoactivated واحدة جزيء تتبع لقياس أنشطة الحمض النووي ملزم وتعريب التحت خلوية من مجموعة من البروتينات المختلفة في E. القولونية بما في ذلك Pol1، يغاز DNA والبروتين الجبهة الاسلامية للانقاذ، والحمض النوويالبلمرة الثالث 7، وكذلك الصيانة الهيكلية للبروتينات الكروموسومات MukB، E، F و19. نحن نتوقع ويمكن أيضا طريقة أن تتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف جوستين بينكني ويوهانس Hohlbein للمساعدة في بناء المجهر مفصل وشيموس هولدن لتوطين البرمجيات. رودريغو رييس-اموث والشكر لتوفير E. سلالة القولونية. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الأوروبي الإطاري السابع جنة برنامج المنح FP7/2007-2013 HEALTH-F4-2008-201418، UK التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث غرانت BB/H01795X/1، ومنحة مجلس البحوث الأوروبي 261227 لANK. وقد تم تمويل DJS بواسطة منحة WT083469 برنامج يلكوم ترست. وأيد SU بواسطة زمالة الدكتوراه ماثووركس.
Materials
| E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein | created by Lambda-Red recombination | ||
| MEM amino acids | Invitrogen | 11130-051 | minimal medium supplement |
| MEM vitamins | Invitrogen | 11120-052 | minimal medium supplement |
| Agarose | BioRad | 161-3100 | certified molecular biology grade |
| Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma-Aldrich | 129925 | CAUTION: toxic |
| PALM setup | home-built | described in Uphoff et al. 2013 | |
| MATLAB | MathWorks | for data analysis and visualization | |
| Localization software | custom-written, available online | http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication. |
| Tracking software | available online | http://physics.georgetown.edu/matlab/ | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier 1996 if used in publication. |
Riferimenti
- Friedberg, E. C. . DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133 (1), 90-102 (2008).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).
- Holden, S. J., et al. Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy. Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).
- Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).
- Wieser, S., Schütz, G. J. Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do’s and Don’t’s. Methods. 46 (2), 131-140 (2008).
- Arnauld, S., Nicolas, B., Hervé, R., Didier, M. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protoc. Exch. , (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).
- Elmore, S., Müller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli. J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).
- Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins. Science. 338 (6106), 528-531 (2012).
