Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien
Summary
Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.
Abstract
Lungenentzündung ist eine der wichtigsten Gesundheitsprobleme in Entwicklungsländern und Industrieländern und ist mit erheblichen Morbidität und Mortalität verbunden. Trotz der Fortschritte in Kenntnis dieser Krankheit, die Verfügbarkeit von Intensivstationen (ICU), und der Einsatz von potenten antimikrobielle Mittel und wirksame Impfstoffe, bleiben die Sterblichkeit hoch ein. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Dieser Erreger ist mit einem Arsenal von oberflächenexponierten Adhäsine und Virulenz Faktoren, die zu einer Lungenentzündung und invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) ausgestattet. Die Bewertung der in-vivo-Rolle von bakteriellen Virulenzfaktoren Fitness oder ist von größter Bedeutung, S. entwirren pneumoniae Pathogenität Mechanismen. Murine Modelle von Pneumonie, Bakteriämie, und Meningitis werden eingesetzt, um die Auswirkungen der Pneumokokken-Faktoren zu bestimmen, verschiedenen Stadien der Infektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Überwachung in Echtzeit Pneumokokken-Verbreitung in Mäusen nach intranasaler oder intraperitoneale Infektionen mit Biolumineszenz-Bakterien. Die Ergebnisse zeigen die Vermehrung und Verbreitung von Pneumokokken in die unteren Atemwege und Blut, die visualisiert und ausgewertet werden kann mit Hilfe eines Imaging-System und die dazugehörige Analyse-Software.
Introduction
Infektionen der Atemwege, die durch Viren oder Bakterien verursacht weiterhin eine der häufigsten ambulant erworbenen oder klinische Probleme verursachen etwa ein Drittel aller weltweit Todesursache weltweit. Die wichtigsten Bakterienarten sind Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae 2. Allerdings sind diese Bakterienarten in der Regel übliche Bestandteile der natürlichen Atemwege Flora. Somit ist die bakterielle Schlitten auch gewisse Gefahr einer invasiven Erkrankung und je nach der Immunstatus oder Prädispositionen der Individuen. Die asymptomatischen Besiedlung auf invasive Infektionen ausgelöst. Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie (CAP) und eine der häufigsten Ursachen von Bakteriämie bei Menschen. Bei gesunden Personen S. pneumoniae (Pneumokokken) sind oft asymptomatisch und harmlos Kolonisatoren der oberen Atemwege, wo sie mit nicht-pathogener Bakterien gegender ansässigen Flora, sondern auch mit Erregern wie Haemophilus spp. oder Staphylococcus aureus und die erste Zeile des menschlichen Immunabwehr. Wagen am höchsten sind bei jungen Kindern (37%) und sogar noch höher im überfüllten Tagesstätten (58%) 3-5. Die jüngste Bevölkerung und ältere Menschen, Erhalt der Pneumokokken über Aerosol-Übertragung von Nasen-Rachen-Sekrete Träger und 6, gehören zu den Risikogruppen und die Impfung mit einem der Pneumokokken-Konjugat-Impfstoffe (PCV10 oder PCV13 bei Kindern und 23-valenten Polysaccharid PPSV23 bei Erwachsenen) ist in den Vereinigten Staaten (US) und vielen europäischen Ländern 4 empfohlen. Die PPSV23 deckt Serotypen für ~ 90% der Pneumokokken-Bakteriämie Krankheiten in den USA und Europa, so effizient verhindert invasive Pneumokokken-Erkrankungen (IPD) bei Erwachsenen verantwortlich, während die PCV decken die häufigsten Serotypen bei Kindern. Folglich durch Impfstoff-Typen (VT) sind IPD reduced aber nonvaccine Serotypen Anzeige eine hohe Virulenz Potenzial und die Antibiotika-Resistenz haben 4,7-12 entstanden. Der Nasenrachenraum als Reservoir ist der Ausgangspunkt für Pneumokokken zu den Nasennebenhöhlen oder Mittelohr Einleitung schädlicher lokaler Infektionen verbreiten. Noch wichtiger ist, Pneumokokken direkt über die Atemwege bis zu den Bronchien und der Lunge, was zu lebensbedrohlichen CAP 4,13 verbreiten. Lungenentzündungen sind oft mit Gewebe-und Barriere Zerstörung begleitet, so dass die Erreger in die Blut verbreitet und verursacht IPD. Inzidenz von GAP und IPD höchsten sind bei immungeschwächten Personen oder an den Extremen der Alters 4,13. Die für die Umwandlung von einem kommen auf einen Erreger mit hoher Virulenz verantwortlich Umstände sind noch immer umstritten. Doch neben Veränderungen in der Wirtsempfindlichkeit und evolutionäre Anpassung begleitet mit höheren Virulenz und die Zunahme der Antibiotika-Resistenzen wurden vorgeschlagen, um einen entscheidenden Einfluss auf pne habenumococcal Infektionen 14-16.
Der Erreger ist mit einer Vielzahl von Adhäsine Vermittlung innigem Kontakt an Epithelzellen der Schleimhaut dotiert. Nach Überwindung der Atemwege Schleim, ist die Einhaltung Pneumokokken an Wirtszellen über direkte Interaktionen der Oberfläche exponierte Adhäsine mit zellulären Rezeptoren und durch die Nutzung extrazellulären Matrixkomponenten oder Serumproteine als Brückenmoleküle 4,17,18 erleichtert. So vielseitig Erreger Pneumokokken sind auch mit Faktoren in Umgehung der Immunabwehr beteiligten Mechanismen ausgestattet. Darüber hinaus haben sie die Fähigkeit, sich an verschiedene Wirts Milieus wie der Lunge, Blut und Rückenmarksflüssigkeit (CSF), jeweils 5,17,19,20 anzupassen.
Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren auf die Pathogenese und entzündlichen Wirtsreaktionen in experimentellen Tiermodellen der Pneumonie, Bakteriämie sucht oder Meningitis 21-25. Obwohl er ein humanes Pathogen, wir sind diese Modellell-gegründet, um Pneumokokken Gewebetropismus, Virulenz Mechanismen oder Protektivität der Pneumokokken-Impfstoff-Kandidaten zu entziffern. Der genetische Hintergrund des Inzucht-Mausstämmen bestimmt die Empfindlichkeit gegen Pneumokokken. BALB / c-Mäuse intranasal mit Pneumokokken infiziert waren resistent zu sein, während CBA / Ca und SJL-Mäuse waren empfindlich gegen Pneumokokken-Infektionen 22. Dies impliziert, dass, ähnlich wie beim Menschen, den genetischen Hintergrund und die Abwehrmechanismen des Wirts zu bestimmen, das Ergebnis der Infektion. Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich, um den Widerstand Loci im Genom der Mäuse weniger anfällig für Pneumokokken-Infektionen zu entwirren. Die Ergebnisse wurden auf Veränderungen in vivo Virulenz Protokolle geführt. Anstelle der Inzucht BALB / c-Mäuse in der Vergangenheit oft verwendet, werden die sehr anfällig CD-1/MF1 outbred Mausstämme heutzutage oft verwendet, um die Wirkung von loss-of-function Pneumokokken Virulenz oder Fitness Faktoren 26-28 studieren. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeitbiolumineszierender Pneumokokken und optischen Bildgebungsverfahren ermöglicht die Echtzeit-Biolumineszenz bioimaging von Infektionen. In Pneumokokken die optimierte luxABCDE Gen-Kassette (Plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) hat sich zu einem einzigen Integrationsstelle des Chromosoms durch Transposon-Mutagenese eingeführt worden ist. Biolumineszenz Pneumokokken wurden eingesetzt, um die Dämpfung des Pneumokokken-Mutanten in der Virulenz oder Fitness-Faktoren und ihre Translokation von einem zu einem anderen anatomischen Ort 26,28-31 mangelhaft zu beurteilen.
Hier stellen wir ein Protokoll für die bioimaging der Pneumokokken-Infektionen in einem Maus-Pneumonie oder Sepsis-Modell. Amplifikation und Verbreitung von Biolumineszenz Pneumokokken in intranasal oder intraperitoneal infiziert Mäuse leicht mit der Zeit unter Verwendung eines optischen Abbildungssystems und des gleichen Tieres zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle Versuche an Tieren durchgeführt haben, die von den lokalen Behörden und Ethikkommissionen genehmigt werden. Bei in vivo Experimenten ist die Infektion bakterielle Belastung in den verschiedenen Wirtsnischen der infizierten Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt. Unter diesen experimentellen Bedingungen die Tiere, die vor der Trennung der Bakterien aus dem Blut, des Nasopharynx, bronchoalvelar Spülung oder Organen wie der Lunge, Milz und Gehirn geopfert werden. Um die Anzahl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung im Labor wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Medical Genomics Infektion (FKZ 0315828A) SH unterstützt.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
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