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Neuroscienze

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Published: March 03, 2014
doi:
10.3791/51170
, , ,
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다.

Abstract

정확한 탐지 및 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소 (BONT)의 정량화는 제약, 환경, 식품 샘플 테스트를 위해 필요합니다. 정확한 역가 시험이 BONT 기반의 의약품 제조 및 환자의 안전을 위해 필요합니다 동안 식품의 신속한 본트 테스트는 발생 법의학, 환자 진단 및 식품 안전 테스트에서 필요합니다. 본트 테스트를 위해 널리 사용되는 마우스 생물 검정은 매우 민감하지만, 신속하고 일상 본트 테스트에 필요한 정밀도와 처리량이 부족하다. 또한, 동물의 생물 검정의 사용은 본트 테스트를위한 마우스 생물 검정을 대체 할 수있는 미국 및 해외 의약품 규제 당국과 동물 권리 지지자에 의해 호출 귀착되었다. 여러 생체 대체 시험 법은 간단 버퍼에서 정제 본트와 잘 작동이 개발되어 있지만, 대부분은 매우 복잡한 매트릭스의 시험에 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 여기에서의 검출을위한 프로토콜BoTest 매트릭스 분석을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 본트가 표시됩니다. 분석은 세 부분으로 구성된다 : 첫 번째 부분은 시험을위한 시료의 준비를 포함, 두 번째 부분 행렬에서 BONT를 정화 안티 BONT 항체 – 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 면역 침전 단계이며, 셋째 부분은 절연 BONT의 단백질 분해를 정량화 형광 기자를 사용하여 활동. 프로토콜은 액체와 고체 두 행렬을 사용하여 96 – 웰 플레이트에 높은 처리량 테스트를 위해 작성 4-26 시간의 총 분석 시간은 시료의 종류, 독소로드, 원하는 감도에 따라와 설명서를 준비 약 2 시간을 필요로합니다. 데이터는 인산염 완충 생리 식염수, 의약품, 배양액, 2 % 우유, 신선한 토마토와 본트 / A 테스트를 제시하고 분석의 성공을위한 중요한 매개 변수의 설명이 포함되어 있습니다.

Introduction

보툴리눔 신경 독소 (BoNTs가) 1-3 NG 추정 정맥 인간의 치사량 알려진 치명적인 물질이다 / 1,2 kg. BONT 일곱 구조상 유사한 혈청 형은, 각 셀이 아연 엔도 펩 티다 제 3-5 인코딩 세포질 및 경쇄으로, 흡수 및 전좌 바인딩에 대해 책임 중쇄 도메인으로 구성된 존재 G 통해 레이블. 본트의 절묘한 독성이 부분에서의 결과, 신경 근육 접합부 6에서 운동 뉴런에 자사의 특정 바인딩 및 항목. 일단 뉴런 내부 경쇄 엔도 펩 티다 제는 특별히 클리브 수용성 N-에틸 말레이 미드 구분 인자 부속 단백질 수용체 (SNARE) 소포 융합에 필요한 단백질 중 하나 이상은, 신경 전달 물질 방출을 억제 및 이완성 마비 7-14 선도. 일반적으로 질병 "보툴리누스 중독,"본트에 의해 다이어프램과 늑간 근육의 마비로 알려진 궁극적으로 결과조기 진단과 치료를하지 않는 한 호흡 부전과 죽음이 수신됩니다.

인간의 인성 보툴리누스 중독은 가장 일반적으로 BONT 혈청 형 A, B, E와 관련, 일반적으로 F (BONT / A, BONT / B 등)은 오염 된 음식 (15, 16)의 섭취에서 발생되고 있지만, 상처 보툴리누스 중독의 몇 가지 경우 정맥 주사 마약 사용자 (17, 18) 사이에보고되었다. 미국의 경우, 하나의 세 미만의 어린이가 클로 스트 리듐 포자의 섭취로 인한 유아 보툴리누스 중독 보툴리누스 중독 19-21의 가장 일반적인 형태입니다. 그러나, 부적절한 가정 통조림 및 가공 식품으로 인한 식품 매개 본트의 발생은 미국과 해외 모두에서보고되었다. 2,000에서 2,009 사이 사이에, 인성 보툴리누스 중독의 적어도 3백38가지 경우는 여섯 사망 22 일을 포함하여 전 세계적으로보고되었다. 신속하고 민감하게 인성 보툴리누스 중독의 발생을 감지 할 수있는 능력은 조기 진단에 도움이 할 수있는 중요한 표시이다 (23, 24). 또한, 비용 효과적이고 일상적인 식품 검사 수있는 검출 방법 개선 식량 안보로 이어질 것입니다.

본트의 신경 세포 특이 긴 생물학적 반감기는 또한 강력한 치료합니다. 미국에서는 본트 기반 약물은 화장품 조건 미간 라인, 자궁 경부 디스 토니아, 편두통, 과민성 방광, 사시 등의 신경 근육 관련 질환의 치료를 위해 식품 의약품 안전청에 의해 승인됩니다. 다수의 "오프 라벨"응용 프로그램은 심각한 근육 장애 25-28를위한 고용량 치료를 포함하여 설명되어 있습니다. 과다 복용은 잠재적으로 유해한 부작용의 위험에 환자를두고있는 동안 underdosing이 효과 치료로 이어질 수 있으므로 정확한 독소 정량화, 올바른 투약 중요합니다. 불행하게도, 표준화 된 역가 시험 프로토콜은 본트 기반 약물의 produ 사이의 단위 정의 불평등의 결과로, 제조 업체간에 공유되지 않습니다CTS 29-31.

본트의 표준 시험 BONT 함유 시료를 생쥐에 복강 주사와 죽음의 숫자가 1-7 일 이상 16,32,33 기록되는 마우스 생물 검정입니다. 마우스 생물 검정 5-10 PG BONT / A (34)의 검출 한계 (LOD)에 매우 민감하지만, 동물의 사용에 윤리적 인 문제, 높은 교육 인력의 비용과 동물 시설, 긴 분석 시간 및 부족을 유지 표준화 된 프로토콜은 표준화, 동물성 본트 테스트 및 정량 방법 35-39을 개발하기 위해 호출 결과. 최근, 여러 가지 대체 본트 정량 방법은 마우스 및 인근 마우스 생물 검정 감도 40-49을 제공하는 개발되었다. 이러한 방법은 일반적으로 형광, 질량 분석기, 면역 학적 방법을 사용하고 동물을 사용하지 않고 마우스 생물 검정보다 훨씬 짧은 분석 시간을 제공합니다. 질량 분석은 면역 techniq와 함께 접근 방법단말은 감지하고 BONT 음식과 다른 복잡한 시료에 포함 된 계량 표시했다 있지만, 인사 교육 요구 사항 및 특수 장비의 제한이 분석 50-55. 대부분의 다른 대체 시험 법은 복잡한 샘플 테스트에 쉽게 적용 할 수 없습니다 또는 일상 본트 테스트에 필요한 처리량이 부족합니다. BONT의 극단적 역가 맞게 감도 시험 관내 분석 방법을 개발하고자 할 때 식품 샘플의 점도, 산도, 염 함량, 및 매트릭스 성분의 높은 변수 특성은 특히 어려운 도전을 제시한다. 또한, 이러한 BONT 기반 의약품의 재 부상으로 인한 것과도 간단하고 상대적으로 양성 버퍼 시스템은 크게 체외 BONT 힘 56에 영향을 소금, 알부민, 설탕 안정제 (즉, 부형제)가 포함되어 있습니다. 독소 정화는 샘플 56-59의 간단한 그러나 모두의 정확한 작동 테스트를 위해 필요합니다.

BoTest 매트릭스 분석은 신속하고 높은 처리량을 위해 설계되었으며, 일반적으로 연구소 56, 60에있는 장비를 사용하여 매우 복잡한 시료에서 본트의 일관성을 정량화 하였다. 이러한 분석은 공유 결합하여 샘플로 본트를 격리시키는 한 후 세척하여 매트릭스 화합물을 방해 제거하는 혈청 형 특정 안티 본트 항체에 링크 된 성체의 구슬​​을 사용합니다. 세탁 후, 바인딩 본트의 단백질 분해 활성은 다음 본트 혈청 형이 시험과 호환 기자를 사용하여 최적화 된 반응 버퍼에 계량입니다. 이 기자는 N-말단 시안 형광 단백질 (CFP) 부분과 구성 본트 기판, SNAP25 잔류 141-206 또는 시냅 잔류 33-94로 연결 C-말단 노란색 형광 단백질 유도체 (비너스) 부분으로 구성된 형광 단백질 BoTest A / E 또는 B / D / F / G 기자, 각각 45. 본트로 기자의 분열은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 모니터링됩니다. 때 t그는 기자 CFP의 여기가 CFP 방출 흥미로운 금성 방출을 담금질, 금성 FRET 결과, 그대로입니다. 본트로 기자의 분열은 CFP 방출과 금성 방출 감소의 증가로 이어지는, FRET을 방지 할 수 있습니다. BONT 활동은 정량적 CFP 금성 배출량의 비율을 사용하여 측정 할 수있다. 3 PG 아래 LOD는 높은 처리량 96 웰 플레이트 포맷 (56)을 이용하여 식품의 넓은 범위에서 가능하다. 분석은 비드 표면에 독소의 농도를 수 있기 때문에 감도를 증가가 큰 샘플 볼륨을 사용하여 얻을 수있다.

BoNTs A, B, E, 및 F에 대한 BoTest 매트릭스 분석법이 개발, 식품, 제약, 환경 시료 56, 60과 함께 시험 하였다. 여기, 우리는 (예를 들어, 제약, BONT 버퍼)와 높은 복잡성 (예 : 식품, 환경) 샘플 낮은 복잡성 본트의 검출에 대해 이러한 분석을 실행하기위한 절차를 설명합니다. 구체적인 처리 방법여러 종류의 시료는이 프로토콜에서 해결하고 설명을 생략 종류의 시료는 일반적으로 표시 방법을 조합하여 적용 할 수 위해. 프로토콜은 개발 및 테스트 BONT / A와 함께하지만, 다른 56, 60 설명한대로 각각의 분석을 사용하여 다른 본트의 혈청 형에 적응할 수 있었다.

Protocol

1. 분석 시약의 제조 해동 200X 디티 오 트레이 톨 (DTT), 10 배 매트릭스 바인딩 버퍼 (10X 바인딩 버퍼 이하), 10 배 중화 버퍼 (음​​식이나 산도 불균형 샘플 만), 15 분 동안 10 배 BoTest 반응 버퍼 실온에서 (10X 반응 버퍼 이하) (RT) 나까지 완전히 해동. 이 프로토콜에 사용 된 버퍼와 시약의 목록은 표 1을 참조하십시오. 이 프로토콜에 필요한 재료 및 장비의 목록은 표 2를</str…

Representative Results

설명 된 프로토콜의 단계를 요약 한 도면이도 2에 도시된다. 분석은 샘플의 종류와 원하는 분석 감도에 따라 완료하는 데 4-26 시간 사이에 필요하지만 만 ~ 2 시간 시간 실습. 어 세이는 96 – 웰 플레이트에서 수행하고, 테스트가 수행되는 분류에 따라서는, 접시 당 표준을 포함​​하여 최대 20 샘플 중으로 시험한다. 그림 3은 본트를 사용하는 대표적?…

Discussion

이 프로토콜은 본트 / 복잡한 매트릭스에서 복잡한, holotoxin, 또는 클로 스트 리듐 속의 세균 배양액을 정량화하기위한 절차에 대해 설명합니다. 분석 감도 혈청 및 분석법에 걸쳐 달라질 수 있지만, 각각 매트릭스 세이 56, 60와 다른 BONT 혈청 형 (예 BONT / B, E 및 F)을 테스트 할 때 프로토콜은, 그러나, 동일하다. 이 프로토콜은 가능한 샘플의 모든 유형을 고려하지 않고, 몇몇 수…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 가치있는 토론과 조언을 H. 올리바 레스와 D. Ruge에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NSF SBIR 상 (BioSentinel 주식에 IIP-1127245)와 국방부 계약 (BioSentinel 주식에 W81XWH-07-2-0045)에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo-Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific  VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek  ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Various N/A Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Various N/A Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing.  Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A  Metabiologics N/A Optional, only required for standardization and quantification purposes 
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Scientific 15036
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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).
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