Summary

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em> 클라미디아</em> 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

Published: October 13, 2015
doi:

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

세포 내 세균의 클라미디아의 종에 의해 발생하는 감염성 질환은 성병, 골반 염증성 질환, 실명, 폐렴 가능성이 동맥 경화 1-4을 포함하여 세계 보건에 큰 부담을 유도. 액포 내에서, 숙주 세포와 상호 작용하는 클라미디아의 능력 (포함 되나), 숙주 세포의 성공적인 감염 중요한 결정 요인이다. 포함은 클라미디아 성장을 가능하게하고 동적으로 클라미디아 5의 전체 2~3일 발달주기에 걸쳐 수정 된 새로운 병원성 구획입니다. chlamydiae의 의무적 세포 내 성격은 직접 포함의 독특한 생물학을 연구, 특히 연구 커뮤니티에 많은 과제를 제시한다. 주요 장애는 효율적으로 세포 내 클라미디아 또는 형광 접근하여 그들의 포함를 시각화하는 무능력하고있다살아있는 세포에서 말이지. 최근의 발견은 마지막으로 GFP C를 표현을 생성하는 방법을 공개했다 트라코마 티스 (6); 그러나,이 연구 결과는 아직 포함 특정 라벨을 주도하지 않았습니다. 일부 기술은 박테리아 나 개재물 7,8의 표시에 대해 기재되었지만, 이러한 photobleaching에 비 – 특이 조로 감수성과 같은 단점을 겪는다. 우리 그룹에 의해 중요한 발견은 숙주 세포 (9)을 표현 GFP를 사용하여 포함을 조명하기위한 새로운 전략을 수립. 이 전략은 합리적 이상 520 다 10 분자 포접 막의 극한 투과성을 이용한다. 세포가 안정적으로 특정 세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP 또는 mCherry)를 발현하도록 유전자 조작 된 경우, 클라미디아 흠 형광 자신의 완전한 배제로 놀라운 선명도와 함께 볼 수 있습니다. 이 역 이미징 전략은 모든 엽록소에 대한 흠 즉시 시각화 할 수 있습니다amydia 종과 용이 관심 대부분의 숙주 세포에 대해 적응 될 수있다. 그 유틸리티의 시연으로,이 방법은 클라미디아 종 9 휴대 출구 경로를 공개하고 정의하기 위해 이전에 사용되었다.

여기서, 우리는 또한이 방법을 수행하고, 개재물의 성장 역학에 관한 정량적 데이터 키를 유도하기 위하여 이용 될 수 있는지 보여준다. 또한, 비용 효율적 항체 기반 열거 방법을 대체 할 수 있으며 클라미디아 11 mKate2 발현과 같은 다른 형광 라벨과 협력하여 사용될 수있다. 공구의 이러한 강력한 결합은 살아있는 숙주 세포 내부 클라미디아 포함 막의 물성을 탐사 할 수있다.

Protocol

형광 숙주 세포 라인의 1 세대 / 잘 2 × 10 6 세포에서 6 웰 플레이트에 일 1. 플레이트 293T 세포 (또는 다른 레트로 바이러스 포장 라인) ~ 75 % 합류 다음날합니다. 원한다면, 각각의 레트로 바이러스에 대한 중복 웰 플레이트가 사용될 수있다. 주 2. 대기음 세포 및 2를 가하여 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS + 2 mM의 L- 글루타민). 리포 펙 타민 2000 또는 유사한 시약을 사용하여 제…

Representative Results

세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP)를 발현하는 포유 동물 세포는 살아있는, 감염된 세포 배양에서 클라미디아 흠의 조명을 사용하도록 설계 될 수있다. 클라미디아 감염시, 포함은 숙주 세포 (그림 1)에 검은 반점으로 쉽게 볼 수 있습니다. 형광 부족 개재물의 선명도는보기 및 / 또는 치료 (그림 1)의 여러 분야에 걸쳐 개재물의 자동 식별을 위해 이용…

Discussion

여기에서 우리는 실시간으로 시각화 및 클라미디아 흠의 분석을위한 형광 숙주 세포를 생성하는 실험적인 전략을 설명합니다. 이 공포의 시각화 방법은 시간이 지남에 따라 단일 세포 세포의 인구를 통해 또는에서 클라미디아 개재물의 동적 특성을 조명 추적하고 정량적으로 측정 할 수있는 강력한 능력을 부여한다. 클라미디아 흠을 형광 단백질 표지 세포에서 눈에 띄게 잘 그들?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).

Materials

Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668
Opti-Mem Invitrogen 31985
Polybrene Sigma H9268
0.45 µm filters Fisher 09-719D
G418 Invitrogen 10131
HBSS Invitrogen 14025
DMEM Invitrogen 11995
RPMI 1640 Invitrogen 11875
RPMI 1640 w/o phenol red Cellgro 17-105-CV
Penicillin G Sigma 13752
Cycloheximide Sigma C7698
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II Nunc 154526, 154534

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Citazione di questo articolo
Zuck, M., Feng, C., Hybiske, K. Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells. J. Vis. Exp. (104), e51131, doi:10.3791/51131 (2015).

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