Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts
Summary
De gevestigde techniek om primaire invasieve orthotoop blaaskanker xenotransplantaten te enten vereist laparotomie en mobilisatie van de blaas. Deze procedure toebrengt significante morbiditeit op de muizen, technisch uitdagend en tijdrovend. Daarom hebben wij een hoge precisie, percutane benadering gebruik te maken van echografie begeleiding.
Abstract
Orthotopische blaaskanker xenotransplantaten zijn de gouden standaard om de moleculaire cellulaire manipulaties en nieuwe therapeutische middelen in vivo te bestuderen. Geschikte cellijnen zijn ofwel geënt door intravesicale instillatie (model van nonmuscle invasieve groei) of intramurale injectie in de blaaswand (model van invasieve groei). Beide procedures zijn complex en tijdrovend. Bovendien, de oppervlakkige model zijn tekortkomingen vanwege het gebrek aan cellijnen die tumorigene volgende instillatie. Intramurale injectie, anderzijds, wordt ontsierd door de invasiviteit van de procedure en de morbiditeit voor de ontvangende muis.
Met deze tekortkomingen in het achterhoofd, hebben we aangepast eerdere methoden om een minimaal invasieve benadering voor het creëren orthotoop blaaskanker xenotransplantaten ontwikkelen. Met behulp van echografie begeleiding hebben we met succes uitgevoerd percutane inoculatie van de blaaskanker cellijnen UM-UC1, UM-UC3 en UM-UC13 in 50 athymic naakt. We hebben kunnen aantonen dat deze aanpak tijd efficiënt, nauwkeurig en veilig geweest. Met deze techniek wordt eerst een ruimte gecreëerd onder de blaas mucosa met PBS en tumorcellen worden vervolgens geïnjecteerd in deze ruimte in een tweede stap. Tumorgroei regelmatig gecontroleerd met bioluminescentie beeldvorming en echografie. De gemiddelde tumorvolumes gestaag toegenomen in alle, maar een van onze 50 muizen tijdens de studieperiode.
In onze instelling, deze nieuwe benadering, die blaaskanker xenograft inoculatie kan in een minimaal-invasieve, snelle en nauwkeurige manier is het traditionele model vervangen.
Introduction
Kankeronderzoek is afhankelijk van diermodellen van kanker bij de mens met behulp van cellijnen afgeleid van patiënt tumoren om ons begrip van de tumor biologie verdiepen. Voor in vivo groei analyse onder verschillende behandelstrategieën muizen orthotoop blaaskanker modellen blijven de referentie-standaard 1,2. De inenting van menselijke blaas kankercellen in immuungecompromitteerde muizen (xenotransplantaatmodel) vertrouwt op intravesicale instillatie ("intravesicale model") 3,4,5 of directe injectie in de blaaswand ("intramurale model") 6,7. Beide technieken kunnen ook worden uitgevoerd bij ratten 8,9.
Intravesicale instillatie induceert tumorvorming op het urotheliale oppervlak van de blaas die vervolgens vatbaar zijn voor latere intravesicale instillatie van nieuwe behandelingsmiddelen. Echter, het aantal cellijnen die betrouwbaar tumorigene wanneer via deze methode een beperkt geleverdd een van deze cellijnen, KU7, is onlangs aangetoond in HeLa 4,10. Intravesicale instillatie is ook tijdrovend vanwege noodzakelijk verblijftijden en induceert vaak tumorgroei in aangrenzende elementen van de urinewegen, zoals urethra, ureter en nierbekken 11. Bovendien intravesicale instillatie leidt vaak tot tumorgroei op de vloer van de blaas waar de urineleiders voeren de blaas, en dit kan de bovenste obstructie en gelijktijdig nierfalen veroorzaken.
Primaire invasieve blaaskanker xenotransplantaten die geschikt zijn voor systemische behandelingen worden gemaakt door directe injectie van tumorcellen in de blaaswand 12. Hoewel een groot aantal cellijnen groeien adequaat in dit model, zijn beperking is de invasiviteit van het model in verband met de noodzaak van een abdominale incisie 13. Het model is ook uitdagend leren vanwege de technische problemen bij het injecteren van cellen precies in de spierwandvan de blaas.
Een nieuwe benadering voor orthotope primaire invasieve blaaskanker xenotransplantaten vaststellen muizen ontwikkeld in de categorieën om de bestaande tekortkomingen van de "intramurale model" richten. We konden de percutane ultrageluid geleide injectie van blaaskankercellen optimaliseren in de voorste blaaswand waardoor deze nieuwe techniek met succes plaats van de vastgestelde invasieve model. Bovendien hebben we potentieel verbeterde de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de "intramurale model".
Protocol
Representative Results
Discussion
Bijna alle belangrijke vooruitgang in de behandeling van kanker zal testen in diermodellen nodig voor het starten van klinische proeven. Diermodellen van kanker zijn essentiële hulpmiddelen die onderzoekers in staat stellen om de tumor biologie te bestuderen in vivo. Orthotopische xenotransplantaatmodellen blijft de gouden standaard 1,2 en blijven de meeste flexibiliteit (in termen van selectie van cellijnen) bieden en hebben de meest praktische nut.
De geïllustreerde werkwijze is een minimaal invasieve wijziging van de orthotope model eerder beschreven door Dinney et al.. 12 Wij opgericht xenograft tumoren door ultrageluid geleide percutane injectie van drie verschillende cellijnen die technisch succespercentage van 100%. Bij continue follow-up, 98% van de muizen aangetoond voortdurende toename van het tumorvolume.
Door het uitvoeren van een minimaal-invasieve techniek konden we bestaande beperkingen van de intramurale model pakken. Naast respecting dierenwelzijn, verminderde invasiviteit van deze procedure ook bij aan reproduceerbaarheid van in vivo experimenten door het verminderen van het aantal chirurgische complicaties. Het is zeer de tijd effectief om een abdominale laparotomie en bijbehorende behoefte aan wondsluiting te voorkomen. We waren in staat om een significante daling van de procedure tijd per dier tot 3,4 min (± 1.6). Echter, het grootste voordeel van onze nieuwe benadering is de juistheid ervan. Hoge-resolutie echografie kunnen we de ruimte die door een zoutoplossing injectie onder het slijmvlies van de blaaswand te visualiseren. Deze eerste stap injectie vergemakkelijkt tumorcel injectie in een tweede stap en minimaliseert het risico van tumorcel morsen. Dit in tegenstelling tot de techniek van intramurale injectie na laparotomie, waar het onmogelijk is naaldplaatsing visualiseren en er is altijd een element van onzekerheid over de exacte diepte van de injectie. Ook, zoals we het inenten van tumorcellen strikt in de voorste blaaswand, tumor growth op de achterste blaaswand wordt vermeden. Vervolgens wordt de snelheid van obstructieve complicaties vanwege tumorgroei in de nabijheid van de ureterale openingen is zeer zeldzaam. Deze begeleidende effect geeft langere groei en behandeling periodes.
De belangrijkste beperking van de echogeleide tumorinoculatie is de noodzaak van adequate technische uitrusting. Daarom is de uitvoering van deze procedure waarschijnlijk beperkt tot centra die gespecialiseerd zijn in dierlijke modellen van menselijke kanker. Dit moet samenwerking tussen onderzoeksgroepen te stimuleren buiten deze instellingen en de groepen met expertise in dergelijke nieuwe dierlijke modellen.
Hoewel afhankelijk van de bekendheid met echografie en wat handvaardigheid, dit model is gemakkelijk te leren onder bevoegde instructie. De belangrijkste stap in de procedure is het creëren van een kunstmatige ruimte submucosaal in de blaaswand met een zoutoplossing. Zodra deze ruimte wordt gecreëerd zonder perforatie of de mucosale laag blijft stabiel gedurende enkele minuten. De leiding van de tweede naald in deze ruimte om de tumorcellen te inoculeren is relatief eenvoudig. De belangrijkste complicatie tijdens het maken van de submucosale ruimte is perforatie van de naald in de blaas lumen. De oprichting van een submucosale ruimte blijft echter mogelijk. De naald moet langzaam in de blaaswand worden ingetrokken en de zoutoplossing ingespoten net wanneer de slijmvlieslaag klapt over de punt van de naald. Na deze handeling de submucosale ruimte minder stabiel (zout zal ontsnappen naar de blaas lumen binnen 30-60 seconden) en de injectie van de tumorcellen moet snel worden uitgevoerd. Morsen van tumorcellen in de blaas lumen kan in deze gevallen perforatie van de mucosa. Hoewel het verlies van de tumorcellen uit de intramurale ruimte zou kunnen leiden tot een verminderde tumorvolume tijdens de follow-up, hebben we nooit een intravesicale tumoropname waargenomen.
Een andere mogelijke complication is het morsen van tumorcellen voor de peritoneale holte via het injectiekanaal. We zagen slechts een intraperitoneale tumorcel verspreiding in 50 dieren, en dit gebeurde in een van onze eerste pogingen. We schrijven dit de injectie van te grote tumor celsuspensie volume. Dit werd ondersteund door het feit dat het verminderen van het volume 50-40 ul resulteerde niet in een verdere intraperitoneale morsen.
Deze minimaal invasieve inoculatie van muizen orthotopische blaaskanker xenograft vertegenwoordigt een innovatieve wijziging van de bestaande "intramurale model", profiteert zowel de onderzoeker en de dieren gelijk. De voordelen van dit model bevorderen aanpassing aan andere organen zoals nier, prostaat en lever om orthotope xenograft tumoren op in een minimaal-invasieve manier.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Eliana Beraldi erkennen voor het uitvoeren van virale transductie van tumor cellijnen en Ben Deeley voor zijn instructie over het gebruik van het kleine dier echografie platform.
Dit project werd gesteund door de Duitse Stichting System (DFG; JA 2117/1-1: 1), de Canadian Cancer Society Research Institute en een Mentored Arts Scientist Award van Vancouver Coastal Health Research Institute. De echografie platform werd gefinancierd door de Canadese Stichting voor Innovatie.
Materials
| Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
| RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
Riferimenti
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).
- Kang, M. R., et al. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Xiao, Z., et al. Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).
- Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model. J. Urol. 153, 802-806 (1995).
- Jäger, W., et al. Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa. J. Urol. (13), (2013).
- Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. Gene Ther. 7, 844-851 (2000).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Black, P. C., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).
