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Projeto e operação de uma contínua<sup> 13</sup> C e<sup> 15</sup> N Labeling Câmara de uniforme ou Diferencial, metabólica e estrutural, Fábrica de Marcação por Isótopo

Published: January 16, 2014
doi:
10.3791/51117
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1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Soil Plant Nutrient REsearch,USDA-ARS, 3Department of Soil and Crop Sciences,Colorado State University

Summary

Este método explica como construir e operar um contínuo de 13 C e 15 N isótopo câmara de rotulagem para a rotulagem tecido diferencial planta uniforme ou. Os resultados representativos de metabólica e rotulagem estrutural de gerardii Andropogon são discutidos.

Abstract

Rastreamento isótopos estáveis ​​raros partir de material vegetal através do ecossistema fornece as informações mais sensíveis sobre os processos do ecossistema, a partir de CO 2 fluxos e formação de matéria orgânica do solo a pequena escala de isótopos estáveis ​​de biomarcadores sondagem. Acoplamento vários isótopos estáveis ​​como 13 C com 15 N, 18 O 2 ou H tem o potencial de revelar ainda mais informações sobre as relações estequiométricas complexas transformações durante biogeoquímicos. Isótopo marcado material vegetal tem sido utilizado em vários estudos de decomposição dos detritos e formação da matéria orgânica do solo 1-4. A partir desses e de outros estudos, no entanto, tornou-se evidente que os componentes estruturais do material vegetal comportar de maneira diferente do que os componentes metabólicos (compostos de peso ou seja. Lexiviáveis ​​baixo peso molecular) em termos de utilização microbiana e armazenamento de carbono a longo prazo 5-7. A capacidade de estudar os componentes estruturais e metabólicasseparadamente fornece uma nova e poderosa ferramenta para avançar na vanguarda dos estudos biogeoquímicos dos ecossistemas. Descrevemos aqui um método para a produção de 13 C e 15 N marcado material vegetal que é quer marcado uniformemente em toda a planta ou diferencialmente marcado na planta componentes estruturais e metabólicas.

Aqui, apresentamos a construção e operação de um contínuo de 13 C e 15 N câmara de rotulagem que pode ser modificado para atender às diversas necessidades de pesquisa. Material vegetal uniformemente marcado é produzido por meio de rotulagem contínua de mudas até a colheita, enquanto a rotulagem diferencial é conseguido através da remoção das plantas que crescem a partir das semanas da câmara antes da colheita. Os resultados representativos de crescimento Andropogon gerardii Kaw demonstrar a capacidade do sistema de forma eficiente etiqueta material vegetal nos níveis alvo. Através deste método, foram produzidos de material vegetal com um átomo de 4,4% de 13 C e de 6,7% de átomo 15 </ Sup> etiqueta plantas uniforme N, ou material que é diferencialmente marcado por até 1,29% de átomos de 13 C e 0,56% de átomos de 15 N, na sua metabólica e componentes estruturais (água quente e de água quente extraível componentes residuais, respectivamente). Desafios estão em manter a temperatura adequada, umidade, concentração de CO 2, e níveis de luz em um hermético 13 C-CO 2 atmosfera para a produção de plantas de sucesso. Esta descrição câmara representa uma ferramenta de pesquisa útil para produzir efetivamente uniformemente ou diferencialmente multi-isótopo material vegetal indicado para uso em experimentos sobre o ecossistema ciclo biogeoquímico.

Introduction

Compreender a dinâmica dos processos-atmosfera planta-solo é fundamental para prever com precisão como o global do carbono (C) e nitrogênio (N) função ciclos sob condições ambientais atuais e futuras. Os isótopos estáveis ​​são ferramentas poderosas em estudos quantitativos de-solo-planta atmosfera C e N ciclismo. Rastreamento isótopos estáveis ​​raros partir de material vegetal através do ecossistema fornece informações sensíveis em estudos de ciclos biogeoquímicos, a partir de CO 2 fluxos e formação de matéria orgânica do solo a pequena escala de isótopos estáveis ​​de biomarcadores sondagem por exemplo, 4,8,9. Combinando 13 C rotulagem com 15 N de rotulagem, ou outros isótopos estáveis, tais como 2 H ou 18 S no tecido da planta fornece uma detecção de alta, rastreável substrato, mas complexo para utilização em estudos acoplados de planta e bioquímica do solo. A capacidade de uniforme ou diferencialmente rotular estrutural e metabólica anúncio material vegetalds ainda mais a capacidade para lidar com questões complexas sobre C e N de bicicleta através dos ecossistemas. O benefício da utilização de isótopos marcado material vegetal em estudos quantitativos de C e N de contabilidade, contudo, depende da capacidade para produzir 13 C e 15 N de material rotulado que seja uniforme ou diferencialmente marcado.

Rotulagem Isotope tem sido utilizado em estudos que abordam planta C e N assimilação 10, a alocação de 11 e rizodeposição 12. Uniformemente 13 C e 15 N de material vegetal marcado fornece um substrato marcado complexo para estudos de decomposição 1,4, formação de matéria orgânica do solo, solo 2,6 emissões de CO 2, 4 solo teia alimentar estuda 13, e estudos de solo C tempos de residência 2,14. Estudos utilizando 13 biochar C rotulado de material vegetal marcado também estão começando a revelar novas informações sobre anteriormente negligenciadospiscinas carac solo 15. Enquanto 15 N, 2 H, e 18O etiquetagem são relativamente fácil de conseguir por meio de tratamento de água e fertilizante, o desafio existe na produção de material de planta de modo uniforme 13 C rotulado a 13 C-CO 2 de fixação.

Rotulagem isótopo contínua de mudas para a maturidade em uma câmara selada produz isótopos rotulagem uniforme em toda a planta. Outros métodos, tais como a rotulagem repetida de impulsos 16 e de aplicação foliar ou de drenagem 17,18 não produzem isótopo marcado uniformemente material vegetal, nem uma rotulagem clara diferencial de compostos C-específicos (por exemplo, metabólico vs estrutural) 19. Uma consideração importante na rotulagem isótopo é etiquetagem de eficiência, devido ao alto custo de isótopos raros compostos enriquecidos utilizados na rotulagem. Embora contínuo de rotulagem 13 C tem sido usada no passado 2-4,20, não é do nosso conhecimentouma descrição técnica detalhada publicada de uma câmara de rotulagem contínua com evidência de alta eficiência de marcação e controle preciso da quantidade e uniformidade da rotulagem isótopo.

Na vanguarda da decomposição dos detritos eo solo pesquisa formação de matéria orgânica é o conceito de que o material vegetal metabólica (isto é lixiviado, compostos instáveis, baixos peso molecular) e material vegetal estrutural (ou seja. Lignina, celulose, hemicelulose) são processados ​​de forma diferente em termos de microbiana eficiência do uso, a formação de matéria orgânica do solo, e de longo prazo de armazenamento do solo C 5-7. O material vegetal que é diferencialmente rotulados de seus componentes estruturais e metabólicas, portanto, é uma ferramenta útil para o avanço decomposição dos detritos eo solo pesquisa formação de matéria orgânica. Rotulagem diferencial com isótopos dupla permite rastrear os componentes estruturais e metabólicas separadamente através do ecossistema utilizando um múltiplo piscina isótopo technique 21.

Rotulagem isótopo contínua com 13 C e outros isótopos em uma câmara selada requer muita atenção para plantar condições fisiológicas para maximizar a produtividade da planta e eficiência de marcação isotópica. Picos de temperatura durante o dia devem ser controlados para evitar danos na instalação, quando a crescer em uma câmara hermética. Uma faixa ideal de umidade e temperatura são obrigados a manter aberto estômatos das plantas e absorção de CO 2 22. Altos níveis de umidade causa o embaçamento das paredes da câmara, o que minimiza a disponibilidade de luz e pode danificar a estrutura da câmara. A consideração cuidadosa para isótopo eficiência de marcação, eliminando isótopos abundância natural da câmara (por exemplo, vindo de envasamento com a matéria orgânica do solo) e evitar a exposição ao ar externo é importante quando se trabalha com heavy-isótopos compostos marcados caros.

Aqui, apresentamos um método para a construção e operação de umcontínua dupla 13 C e 15 N isótopo câmara de rotulagem para a produção de material vegetal que é ou uniformemente marcado ou tem seus componentes estruturais e metabólicas rotulados em níveis distintos. 13 C rotulagem é controlado no nível de câmara, enquanto a fertilização e 15 N rotulagem é controlado no nível pote individual. Os resultados representativos são mostrados para demonstrar a capacidade deste método para controlar a temperatura, umidade e concentração de CO 2 durante todo o período vegetativo. Os resultados de crescimento gerardii Andropogon, Kaw também demonstrar a capacidade deste método para a produção de material vegetal de maneira uniforme ou diferencialmente rotulados. O esquema de concepção da câmara e operação específica descrita pode ser modificada de diferentes espécies de plantas, assim como para acomodar 2 H ou 18O rotulagem.

Protocol

1. Construção Câmara Construa a câmara de rotulagem em uma estufa para permitir o máximo potencial de luz natural para o crescimento das plantas. Certifique-se de que a fonte de alimentação adequada está disponível para alimentar todos os componentes da câmara. Construa a câmara de rotulagem com a montagem de 3,175 milímetros de espessura de paredes de acrílico transparente (policarbonato também seria adequado) e uma 6,35 milímetros de teto de acrílico transparente de espessura em uma moldura de alumínio com um piso de aço pintada de branco para maximizar a refletância solar. As dimensões da câmara podem ser adaptados para atender às necessidades individuais de investigação. Monte a câmara em ¾ in (19 mm) de madeira compensada em blocos de concreto. Faça furos no, quadro de alumínio de vidro acrílico e piso de aço e usar parafusos para fixar todos os componentes juntos. Vede todas as costuras com calafetar silicone para garantir uma vedação hermética. Construa um porta montando uma seção dos painéis de acrílico em parafusos longos, o que pode ser aparafusado para baixo, usando remoporcas vable. Selar a porta com o descascamento de tempo para evitar o vazamento de ar. Selecione uma área diretamente adjacente à câmara como o centro de controle para montar tudo de temperatura, umidade, CO 2 controles e equipamentos de monitoramento. Perfurar cuidadosamente pequenos buracos na parede da câmara adjacente ao centro de controle para todos os fios elétricos e tubos de gás. Use calafetar silicone para vedar os buracos ao redor todos os fios e tubos para evitar o vazamento de ar. Teste da câmara de vazamento de ar, preenchendo-o com um alto nível de CO 2 (por exemplo, 800 ppm) e deixá-lo sentar-se durante a noite. Se a concentração de CO2 na câmara é mantida no seu nível original, então é hermético. Se a concentração cai durante a noite, em seguida, todas as costuras devem ser examinados e selados com silicone calafetar até uma vedação hermética é alcançado. Para algumas plantas adaptadas a elevadas condições de luz, adicionar luzes ligadas a um temporizador para o exterior imediato dos cHamber para aumentar a penetração da luz e da produtividade da planta. 2. Temperatura e Umidade Controles Regular a temperatura da câmara através da instalação de um tipo comercial de divisão de ar condicionado com as bobinas de refrigeração (evaporador) localizados no interior da câmara e as bobinas de compressor e condensador localizadas fora da estufa para dissipar o calor. Definir o condicionador de ar para manter a temperatura desejada. Use uma pequena sala de desumidificador para controlar a umidade dentro da câmara. Perfurar um furo de drenagem através do chão da câmara adjacente ao desumidificador. Retirar o colector do condensado a partir do desumidificador, e ligar um tubo de drenagem do desumidificador através do orifício de drenagem no chão da câmara. Debaixo da câmara, coloque um frasco aberto cheio de água para o desumidificador para drenar directamente para. Isso cria uma vedação hermética, mas também para permitir o equilíbrio de pressão. <li> Instalar um controlador, tais como o controlador Omega iSeries, no centro de controle com um sensor de umidade dentro da câmara. Conecte o controlador para o sistema de desumidificação com um relé de estado sólido e definir o controlador de umidade com um alarme alto e swing para manter as condições ideais de cultivo na câmara. Condições de temperatura e umidade ideais serão diferentes para diferentes espécies vegetais. 3. CO 2 Controles O enriquecimento de 2 13 C-CO é conseguida usando dois dois tanques de gás puro de CO, um átomo de 10 13% de C-CO 2 ou superior e um átomo de 1,1% de 13 C-CO 2 (abundância natural). Monitorizar a concentração de CO 2 por ter uma bomba de diafragma continuamente extrair o ar da câmara por meio de um analisador de gás de infravermelhos (IRGA) e em seguida bombear o ar para dentro da câmara, mantendo-se assim um sistema fechado (Figura 1). Seta baixo alarme e banda morta no software IRGA para manter as concentrações de CO 2 dentro de uma faixa desejada. Aqui, usamos um alarme baixo de 360 ppm com uma banda morta 40 ppm para manter concentrações de CO 2 entre 360-400 ppm. Conecte uma válvula de medição para cada tanque e ajustá-los cuidadosamente para alcançar o nível C enriquecimento alvo 13. Defina os reguladores do tanque para 20 psi. Inserir uma válvula de solenóide entre a válvula de medição e o regulador de cada tanque. Junte-se às saídas das duas válvulas de medição juntos e tubo-los para o centro da câmara. Fio de um relê de estado sólido para a saída IRGA para controlar as válvulas de solenóide (Figura 1). 4. Sistema de Monitorização Remota baseada na Web Monitorar concentrações de CO 2 a partir do software IRGA por registrá-lo em um arquivo local, uma vez a cada 30 seg. Criar um utilitário personalizado (por exemplo, em perl ou outra linguagem de programação) para escolherentradas a partir do arquivo de log locais CO 2, juntamente com a data e hora do laptop atual, e enviá-los para uma aplicação web back-end. Defina a aplicação web para consultar a temperatura e os dados do sensor de umidade. Usar um sistema de controlo para verificar o estado da temperatura na câmara de cinco em cinco minutos, para evitar picos de temperatura potenciais que destroem as plantas, se o sistema de ar condicionado falhou. Monitorar os dados de CO 2, temperatura e umidade em qualquer navegador padrão para que todos os picos de temperatura inesperados ou CO 2 gotas podem ser atendidos imediatamente. 5. Sistema de Irrigação Fure um pequeno buraco na parede da câmara de vidro acrílico por vaso. Utilize tubos de irrigação para criar um anel de irrigação por gotejamento por vaso e alimentar o tubo de irrigação, através da parede da câmara para o exterior. Selar os furos ao redor do tubo de irrigação com silicone calafetarpara evitar o vazamento de ar. No exterior da câmara, ligar o tubo de irrigação para o tubo de uma bomba peristáltica. Use uma pequena braçadeira para fechar toda a tubulação de irrigação para evitar fugas de ar entre as regas. 6. Envasamento plantas Selecione um tamanho de panela apropriada para as plantas sendo cultivadas. Aqui, 40, 15 L potes são utilizados. Criar um substrato livre de solo, misturando areia, vermiculita, e perfil de cerâmica porosa. Testar a capacidade de retenção de água do substrato pesando um pote seco cheio, absorvendo a panela com água e permitindo que ele para drenar completamente, e pesando o pote molhado. Utilize esta capacidade máxima de retenção de água para garantir que o excesso de fertilizante marcado e água não vaza dos potes durante a rega. Germinar sementes em envasamento solo antes de plantá-las em vasos. Isso garante que as sementes germinadas com sucesso só são iniciados na câmara de rotulagem. Inocular t ele mudas com pasta fresca solo para introduzir micróbios benéficos. Uma vez que as sementes germinadas, transplantar cuidadosamente mudas para os vasos do número desejado. Uma vez envasadas, mova os potes para a câmara e montar cada pote com uma mangueira de irrigação individual. 7. Vedação da Câmara Quando a primeira vedação da porta para a câmara de uma grande massa de ar externo enche o espaço da câmara. Esfregue esta CO externa 2, ligando um purificador refrigerante de limão para a bomba de ar para esfregar a concentração de CO 2 até, pelo menos, 200-250 ppm antes de encher a câmara de volta até 400 ppm utilizando a mistura de tanque de 13 C-CO 2. Tente manter a câmara fechada através da duração da estação de crescimento para minimizar a abundância natural CO 2 contaminação. Monitorar o crescimento das plantas visualmente e ajustar a fertilização e irrigação de acordo com a demanda. itle "> 8. fertilização e irrigação Use uma solução de fertilizantes, tais como a solução de um Hoagland modificada 23, para fertilizar as plantas através do sistema de irrigação. Rotular o fertilizante com 15 N, usando a 15 N-KNO 3 subsolution no átomo% alvejado 15 N nível, misturando 98% de átomos de 15 N-KNO 3 com abundância natural de 15 N-KNO 3 (0,37% de átomos de 15 N). Misturar-se o suficiente da solução de fertilizante a cada evento de fertilização para toda a câmara, com base na capacidade de retenção de água da mistura de envasamento. Coloque a quantidade adequada de fertilizante para uma panela em uma jarra de vidro, e preparar tantos frascos há potes. Soltar as mangueiras de irrigação e coloque cada um deles em um frasco com a solução de fertilizantes, e, em seguida, conectá-los para a bomba peristáltica. Plantas de água por bombeamento de água através da bomba peristáltica através do IRRI gotejamento indivíduomangueiras gação regularmente como as plantas precisam. Adubação com solução de Hoagland devem seguir a demanda da planta ou projeto experimental, com o aumento da demanda de nutrientes com o aumento da produtividade da planta para maximizar a produtividade. Primeiro, bombear a solução do Hoagland através da mangueira de irrigação, então bombear água através de uma lavagem para minimizar o crescimento de algas e bactérias nos tubos. Reclamp todas as mangueiras após a fertilização e irrigação para eliminar o vazamento de ar câmara. 9. Uniforme e Diferencial Labeling Para a rotulagem diferencial de componentes estruturais e metabólicas, retirar plantas da câmara de rotulagem 1-3 semanas antes da colheita. As plantas que estão a ser uniformemente marcado pode permanecer na câmara de rotulagem selado de forma contínua até a colheita e irrigado com solução de 15 de N-Hoagland. Manter as plantas retiradas na estufa durante este tempo para que eles recebam luz adequadae CO 2 em abundância natural 13 C. Para diferencial 15 N rotulagem, continuar a fertilizar e irrigar as plantas, como de costume, mas o uso de abundância natural de 15 N-KNO 3 em solução de fertilizantes do Hoagland. 10. Colheita Pare de regar as plantas 1 semana antes da colheita para que as plantas começam a senesce e substrato resseca. Abra a câmara e mover as panelas para fora para recorte imediato e colheita da biomassa acima do solo Despeje a mistura de envasamento e raízes sobre uma tela grossa. Use a tela para separar as raízes do substrato e sacudir as raízes livres de substrato. Coloque as raízes numa peneira de 2 mm e lavá-los com água para remover qualquer material de encapsulamento restante. Use uma pinça para remover qualquer vermiculita que podem agarrar-se às raízes. Permitir raízes secarem naturalmente, em preparação para futuros experimentos. <p class = "jove_title"> 11. Litter Química Pesar o material vegetal seco ao ar para determinar a biomassa câmara de rotulagem. Moer uma subamostra para análise química. Colocar 2,0 g de forno de areia seca (60 ° C) em um frasco de 125 ml de ácido lavou-se e adicionar 50 ml de água deionizada. Colocar a amostra de um pré-aquecido (60 ° C), placa de agitação e colocar uma barra de agitação no frasco. Defina-se a agitação para 200 rpm e permitir que a amostra a aquecer durante 30 min. Após 30 minutos, filtrar a solução através de uma maca mM 20 Malha de nylon sobre um sistema de filtração com vácuo. Transfira o extrato para um tubo de ácido lavado previamente pesado e congelar. Transferir o resíduo lixo sólido a uma panela de alumínio pré-pesado e seco a 60 ° C. Pesar pan e lixo após secagem para determinar a massa de resíduos de água quente. Congelar secar o extrato de água quente e pesar para determinar a massa do extrato de água quente. Analisar seco em estufa (60 ° C) de areia, água quente liofilizadosextrato, e seca em estufa de resíduo de água quente em um analisador elementar – razão isotópica Espectrômetro de Massa (EA-IRMS).

Representative Results

A nossa câmara de rotulagem é de 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m de tamanho e detém 40,15 L potes (Figura 1). O sistema de controle computadorizado IRGA mantido concentrações de CO 2 entre os nossos valores ajustados de 360 e 400 ppm, durante o período fotossinteticamente ativa do dia (Figura 2a). O recurso baixo CO 2 alarme no IRGA desencadeada válvulas solenóide para permitir CO 2 a partir do 13 C enriquecido e tanques de abundância natural na câmara quando a concentração caiu abaixo do limite mínimo (por exemplo, 360 ppm). O recurso banda morta parou o fluxo quando a concentração atingiu o ponto de ajuste superior (por exemplo, 400 ppm). A temperatura iSeries e sistema de monitoramento de umidade ligado ao ar condicionado e desumidificador realizado condições climáticas dentro dos parâmetros estabelecidos por toda a estação de crescimento (Figura 2b). Nós usamos um de uma tonelada (3,5 kW) aparelho de ar condicionado para keep a câmara fria. O sistema de monitoramento remoto permitiu que os dados registrados para ser visto a qualquer momento por um navegador web padrão. Os valores de duas concentrações, temperatura e umidade de CO foram amostrados para baixo pelo aplicativo da Web para exibir gráficos na última 24-240 horas, em incrementos de 24 h. Isto criou um visual rápido para confirmar que as flutuações diárias estavam dentro dos limites esperados. Visualizando a interface web também mostrou o status atual da câmara, bem como alertas previstos para problemas potenciais, como não receber dados recentes. A qualquer momento, o conjunto de dados completo também pode ser baixado a partir da interface web. Nós medimos a radiação fotossinteticamente ativa (PAR) no interior e exterior da câmara em quatro pontos com e sem as luzes acesas no meio do verão e no meio do dia, utilizando um sensor de quantum imediato. O PAR na câmara foi de 31,5% menor do que o exterior, quando as luzes da câmara wantes de fora e 22% menor do que o exterior quando as luzes estavam acesas. Assim, as luzes da câmara de ajuda para aumentar significativamente a penetração PAR dentro da câmara de 9,5% (P <0,05). Nosso sistema de rotulagem contínuo foi capaz de produzir 2.759 g de A. biomassa gerardii, 37% do que era biomassa acima do solo e 63% do que era biomassa abaixo do solo. Conseguimos um 13 C todo rótulo planta 4,4% de átomos em nosso material vegetal uniforme, definindo as válvulas solenóides nos dois tanques de CO 2 em conformidade (Figura 1, Tabela 1). Alcançamos a 15 N todo rótulo planta 6,7% de átomos em nosso material vegetal uniforme, misturando 98% de átomos de 15 N-KNO 3 com 0,37% de átomos de 15 N-KNO 3 no KNO 3 subsolution de solução de um Hoagland modificada 23 (Tabela 1) . Nós regada a A. semanal gerardii com 750 ml de líquidos totais (água e solução de Hoagland) em todo o crescente marfilho. Nós fertilizado com 200-500 ml de 15 N rotulado solução de Hoagland por semana, dependendo da produtividade da planta. Utilizamos o método de extração de água quente para determinar se havia diferenças isotópicas entre o material vegetal diferencialmente rotulados e uniforme. Para as plantas diferencialmente rotulados, após a colheita, removemos todas as folhas que estavam completamente mortos e tratados estes separadamente, como eles não eram provavelmente diferencialmente rotulados. Ao olhar para 13 o teor de C, todos os quatro dias de incorporação foram significativamente diferentes umas das outras por toda a planta e o extracto de água quente, mas para os dias resíduo de água quente 14 e 22 não foram significativamente diferentes umas das outras (Tabela 1). Ao comparar as fracções de tecidos de plantas em cada dia, o extracto de água quente e de resíduo foram significativamente diferentes umas das outras para todos os quatro dias e por dia 22 toda a planta, extracto, resíduo e foram todos signicativamente diferentes umas das outras (Tabela 1). Para o N incorporação em 15 componentes da planta, houve diferença entre os dias de incorporação e tecidos vegetais frações. Para o extrato de água quente todos os quatro dias de incorporação foram significativamente diferentes entre si por 15 N, e para toda a planta ea água quente resíduo os dias mais curtos de incorporação foram significativamente diferentes do que os mais longos dias de incorporação (Tabela 1). As fracções de tecido de plantas nas plantas uniformes e não foram significativamente diferentes umas das outras em 15 N, mas o extracto de água quente e de resíduo foram significativamente diferentes umas das outras em 15 N, para o maca diferencialmente marcado. Todos os valores isotópicos são referidos usando o átomo por cento (% atom) notação (Equação 1), que é uma notação mais preciso do que a% de usar em níveis elevados de pesadoisótopo enriquecimento 21. Por exemplo: (1) Para este estudo, fizemos análises estatísticas usando SAS versão 9.2. Nós testamos as diferenças entre os níveis de luz interior e exterior da câmara utilizando um teste t pareado. Testamos diferenças entre 13 C e 15 N rotulagem de extratos de água quente e resíduos água quente através da análise de um de variância (ANOVA) em PROC ANOVA. Foi utilizado o teste de Duncan para a análise de comparações múltiplas. A significância foi aceito em um nível P de 0,05. Foi utilizado um teste de Wilcoxon rank sum para testar se os dados cumpridos os pressupostos da análise. Figura 1. Schematic diagrama do contínuo multi-isótopo rotulagem câmara de 40 pot capacidade de visão do olho do pássaro. As linhas pontilhadas representam a fiação elétrica, enquanto as linhas sólidas representam a gás ou a tubulação de água. Clique aqui para ver imagem ampliada. . Figura 2 A) CO Média 2 concentração (ppm) (+ / -. SE) durante um período de 24 horas para toda uma época de crescimento B) Temperatura Média (º C), círculos abertos e umidade (%), círculos fechados . (+ / – SE) durante um período de 24 horas para toda uma época de crescimento Clique aqui para ver maior imidade. Uniforme (0) Diferencial (7) Diferencial (14) Diferencial (22) Whole Litter 13 C Atom% 4,46 ± 0,02 Aab 3,93 ± 0,05 Ba 3,64 ± 0,03 Ca 3,35 ± 0,06 Db 15 N Atom% 6,69 ± 0,07 Aa 6,72 ± 0,01 Aa 6,33 ± 0,06 Ba 6,41 ± 0,07 Ba <td height="38" rowspan = "estilo" "2" = "height: 38px; width: 77px;"> Extrato de Água Quente 13 C Atom% 4,59 ± 0,04 Aa 3,35 ± 0,06 Bb 2,79 ± 0,06 Cb 2,37 ± 0,03 Dc 15 N Atom% 6,69 ± 0,03 Aa 6,43 ± 0,01 Bb 5,89 ± 0,07 Db 6,16 ± 0,05 Cb Resíduo de Água Quente 13 C Atom% 4,37 ± 0,06 Ab 4,1 ± 0,03 Ba 3,79 ± 0,10 Ca 3,66 ± 0,05 Ca 15 N Atom% 6,57 ± 0,04 Ba 6,71 ± 0,02 Aa 6,45 ± 0,02 Ca 6,44 ± 0,03 Ca Tabela 1. <strong> Composição isotópica e química da maca para uniforme e lixo diferencialmente rotulados. Dias de rotulagem diferencial fora da câmara estão entre parênteses. As comparações entre dias de incorporação estão em letras maiúsculas (linhas) em todo e entre as frações de areia são em letras minúsculas (para baixo colunas) para cada variável.

Discussion

Este design para uma câmara de marcação isotópica contínuo foi utilizado para produzir de forma uniforme e diferencialmente 13 C e 15 N marcado A. gerardii para o campo seguinte e experimentos de laboratório. Durante três estações de crescimento de operação, a câmara manteve com sucesso temperatura, umidade e concentrações de CO 2 dentro dos parâmetros estabelecidos (Figura 2). A confiabilidade do sistema de controle de temperatura é fundamental durante o pico do verão, quando a radiação solar elevada pode causar o superaquecimento da câmara hermética. Eliminar o excesso de umidade causada pela transpiração das plantas que crescem garante que estômatos planta permanecerá aberto para captação fotossintética 22 e que a condensação de água não inibe a penetração da luz ou danificar a estrutura da câmara.

A monitorização contínua perto da concentração de CO 2 pelo software IRGA mantida contínua13 C rotulagem das plantas, enquanto eles estavam crescendo na câmara. Devido à alta atividade fotossintética de A. gerardii crescente nesta câmara, CO 2 foi injetado no sistema com freqüência durante o dia da temporada de pico de crescimento, quando a atividade fotossintética desenhou concentrações de CO 2 até 360 ppm, aproximadamente a cada 15-20 min. A medição da abundância natural enriquecido e 13 C-CO 2 tanques permitidos para um átomo de 4,4% de 13 C em atmosfera controlada através da estação de crescimento para a rotulagem de tecidos de plantas uniforme 13. C-CO 2 de produção também pode ser conseguida pela mistura de 13-C de sódio bicarbonato ou carbonato de C-13 de sódio e ácido clorídrico, no entanto, este tipo de sistema é mais complicado e requer mais monitoramento e manutenção, por isso recomendamos o uso de 13 C-CO 2 gás. Uma consideração importante para o monitoramento de CO2 concentrations utilizando um IRGA é que os analisadores de infravermelho perder dois terços da sua sensibilidade ao medir 13 C-CO 2. Essa subestimação de cerca de 2,9% ppm para nossa mistura de 4,4% de 13 C-CO 2 não foi de grande preocupação para nós, mas poderia se tornar um problema mais significativo quando rotulagem em níveis mais elevados de 13 C 27.

A. gerardii é uma estação quente tallgrass perenes pradaria espécies gramíneas. O design desta câmara foi otimizado para A. produção gerardii (Figura 1). O tamanho ea altura da câmara foram escolhidos em consideração para a produtividade máxima altura de A. gerardii no campo, assim como para a produção de biomassa vegetal desejada para experiências futuras. A. gerardii é conhecido por ser limitada luz no campo 24,25. PAR dentro de uma estufa pode ser diminuída por 30-47%, em comparação com os níveis de exteriores 26. Desde a nossa fábricas foram cultivadas em uma câmara de vidro acrílico dentro de uma estufa, a limitação PAR foi uma preocupação. Quando ligado, as luzes fluorescentes aumento PAR dentro da câmara de 9,5%, o que pode ter ajudado a aumentar a produtividade nesta luz espécies sensíveis. Ao utilizar este desenho da câmara de crescer outros tipos de plantas necessidades fisiológicas específicas, tais como tamanho, iluminação, exigências nutricionais, sensibilidade à temperatura e umidade do solo deve ser cuidadosamente adaptado para manter as condições ideais de crescimento para as plantas.

Quando se trabalha com caras compostos marcados isotopicamente, tal como 10% de átomos de C-13 de CO 2 e 98% de átomos de 15 N-KNO 3, a eficiência de marcação é uma consideração importante. Este projeto câmara optimiza 13 C rotulagem, fazendo todos os esforços para selar a câmara e minimizar o vazamento de ar para dentro e para fora da câmara. Se esta câmara nunca foi aberta durante o período de crescimento, então nenhum de o rótulo 13 Ced CO 2 a partir da câmara é vazado para fora para a atmosfera. O CO 2 construir durante a respiração noturna não parece danificar as plantas que crescem e é levado rapidamente para cima depois do nascer do sol (Figura 2). Durante a etiquetagem diferencial, a câmara foi brevemente aberto para remover as panelas diferencialmente marcadas, mas esta não parece diluir a 13 C de 4,4% de átomo rotulagem específica das plantas continuamente marcadas (Tabela 1). Rotulagem 13 C também foi optimizada por lavagem a ar atmosférico inicial retido na câmara de vedação em cima. Durante os testes preliminares sobre a câmara sem uma esfoliação inicial de CO 2 atmosférico, as plantas foram medidos a ter um nível diluído 13 C nas primeiras folhas produzidas do que nas folhas posteriores produzidos. A esfoliação inicial de CO 2 atmosférico no encerramento câmara aparece para eliminar este problema, permitindo a contínua rotulagem 13 C demudas até o vencimento. A manutenção de uma mistura livre de envasamento solo de areia, vermiculita e argila também elimina abundância natural CO 2 contaminação de respiração do solo. A eliminação do solo a partir do sistema não exige considerações de fertilização e de inoculação cuidadosas, que pode ser único para diferentes espécies de plantas. 15N rotulagem através da 15 solução de 7% de átomo de N Hoegland alvo produzido material vegetal altamente rotulado a 6,7% de átomos de 15 N (Tabela 1). Uma ligeira diluição do 15 N-alvo pode ser causada por alguma abundância natural de N no substrato ou a partir da inoculação do solo nativo.

Durante a biossíntese de compostos, discriminação natural de 13 C (15 ou N) ocorre como resultado do fraccionamento cinética e distribuição de isótopos nonstatistical nos compostos sintetizados. Assim, no caso de C, os produtos secundários (por exemplo, lípidose compostos fenólicos) são geralmente empobrecido em 13 C, em comparação com os produtos primários (hidratos de carbono). Este naturais discriminação 13 C parece persistir também quando as plantas são cultivadas em uma atmosfera enriquecida de 13 C, como pode ser visto na pequena diferença no átomo de C 13% de extractos de água quente e os resíduos de água quente das plantas uniformemente marcadas (Tabela 1 ). Este fraccionamento cinética natural é muito pequena em comparação com o enriquecimento e não compromete a uniformidade de rotulagem.

Rotulagem diferencial de tecidos de plantas estruturais e metabólicas é uma nova técnica com potencial para estudos avançados em decomposição lixo, ecologia microbiana e formação de matéria orgânica do solo. A diferença de 13 C e 15 N dos extratos de água quente e resíduos água quente indica uma diluição significativa de 13 C e 15 N no lixiviado, baixocompostos de massa molecular (extractos de água quente) a partir do material de planta estrutural (resíduos de água quente) após 7, 14 e 22 dias de rotulagem diferencial (P <0,005). Esta rotulagem diferencial dos tecidos vegetais podem ser usados ​​para rastrear o destino dos componentes estruturais e metabólicas separadamente através de um ecossistema. A rotulagem diferencial de 13 C foi mais extrema do que 15 N rotulagem diferencial. Isto pode ser devido à imediação de diluição 13 C durante a remoção das plantas da atmosfera 13 C-CO 2 marcado, enquanto que o 15 N permanece na mistura de envasamento durante algum tempo e 15 N de diluição ocorre mais lentamente. Para mais rotulagem diferencial drástica de 15 N, pode-se considerar a lavagem das panelas com água antes da fertilização abundância natural durante as últimas semanas de crescimento fora da câmara.

A concepção e funcionamento deste contínua 13 </ Sup> C e 15 N sistema de rotulagem para, rotulagem estrutural tecido vegetal uniforme ou diferencial, metabólicas e proporciona um novo método para a produção de material vegetal marcado isotopicamente para pesquisa avançada. A concepção eo funcionamento desta câmara ter sido escolhido por 4,4% de átomos de 13 C e 7% de átomos 15 N rotulagem de A. gerardii, mas pode ser adaptado a outros tipos de plantas e os níveis de marcação isotópica. As condições de crescimento descritos aqui devem ser adaptados para atender o tamanho, temperatura, umidade, luz, água e nutrientes demandas de determinadas espécies vegetais de interesse. A marcação com 18 S ou H 2, também pode ser alcançada através da marcação da água utilizada no sistema de irrigação. O sistema descrito aqui resolve muitos dos desafios de uniforme e diferencial de 13 C rotulagem de material vegetal. Este desenho básico da câmara pode ser utilizado por outros grupos de investigação para produzir material de planta muito marcada para advestudos em biogeoquímica de ecossistemas ANCED.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Um agradecimento especial para o Crescimento Facility Planta e EcoCore facilidade analítica na Colorado State University e aos muitos estudantes e professores que ajudaram neste projeto. Este trabalho é financiado pela NSF DEB concessão # 0918482, o USDA National Needs Fellowship, eo fundo Cotrufo-Hoppess para pesquisa ecologia do solo.

Materials

40 in Remote Tower Fan Living Accents FS10-S3R-A
42 in Electric Tower Fan with remote control LASKO 2559
Mr. Slim Split-type air conditioner Mitsubishi Electric R410A
Electronic 24 hr time switches Intermatic ET100C Operates Fluorescent Light System
iSeries Humidity and Temp Controller Omega CHiTH-i8DV33-5-El
Solid State Relay Omega SSRL240
CKR Series Solid State Relay Crydon
Solenoid Coils Dayton 6X543
GasHound CO2 Analyzer LI-COR LI-800
Dehumidifier Dayton 1DGX4
Specialty gas regulator Airgas CGA 580
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System Hydro Farm FLT48
Air pump Thermo Scientific 420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem Cole Parmer 7553-70
1900 Series Network Switch Catalyst
Profile Porus Ceramic Top Dressing Greens Grade
Industrial Quartz 40 mesh Unimin 4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium ProMix
Vermiculite and Perlite Thermo-Ran C633
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % Sigma-Aldrich 335134
Carbon-13C Dioxide 10 atom % Sigma-Aldrich 600180
Medical grade CO2 Airgas
Regulator Airgas  CGA 350
4 in box fans Grainger
Masterflex PharMed BPT Tubing Cole Parmer HV-06508-24
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Riferimenti

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Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., Boyack, T., Haddix, M. L., Stewart, C. E., Cotrufo, M. F. Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (83), e51117, doi:10.3791/51117 (2014).
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