Выражение функциональных рекомбинантного гемагглютинина и нейраминидазы белков от вируса H7N9 Роман гриппа Используя выражение бакуловирусной системе

В первой реакции на появление в последнее время романа H7N9 гриппа штамма вируса в Китае, мы приобрели плазмиды, несущие геномные последовательности для гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гены первых двух изолятов. Используя эти плазмиды, мы смогли быстро построить бакуловирусные векторов экспрессии для получения рекомбинантного HA и NA в клетках насекомых. Эта система выражение хорошо известна в нашей лаборатории и доказал решающее значение для многих наших текущих исследовательских проектов ^1-8. Клетки насекомых способны правильно сложить и посттрансляционно изменить сложные белки. Эти модификации включают N-гликозилирования, что очень важно для многих вирусных гликопротеинов. Таким образом, неудивительно, что система бакуловирус достаточно создана для выражения вируса гриппа поверхностные антигены. На самом деле, многие из кристаллических структур ГК и НС были решены с использованием клеток насекомых, выразил белков ^9-11. Еще одно преимуществоСистема заключается в его надежных высоким содержанием белка выходом до 30 мг культуре клеток HA / л (на основе нашего опыта работы с более чем 50 различных белков HA) – следствие вирус-инфицирования в выражении от сильного промотора полиэдрина.

Удаление трансмембранным и endodomain белков HA и NA позволяет для экспрессии секретируемых, растворимых версий белков и, таким образом, значительно облегчает процесс очистки. Кроме того, эти эктодомены которые помечены гексагистидиновую и, следовательно, может быть очищен с помощью аффинной хроматографии с использованием Ni ^{2 +-смолы.} Трансмембранные домены ГК и NA белков способствуют гомотримера и формирование гомотетрамера соответственно. Для того чтобы сохранить эти oligomerizations, мы добавляем С-концевой домен тримеризации для HA-и N-терминал тетрамеризации домена НС строит (рис. 1). Мы убедительно показали, что такая область тримеризация стабилизирует функциональное, последстrved конформационные эпитопы на стебель-домена ГК ^1. Правильный тетрамеризации НС также может способствовать правильной укладки и функцию NA ^10. Последовательности и векторы baculo-передачи, несущие тримеризации или тетрамеризации домены могут быть запрошены у авторов или из других лабораторий в ^{области, 9,10,12.}

Другим важным вопросом для экспрессии секретируемых белков в клетках насекомых является выбор правильного клеточной линии. В то время как Spodoptera frugiperda получены Sf9 клетки поддерживают бакуловирусной репликацию очень хорошо, и, как правило, используется для вируса спасательных и распространения, они обладают ограниченными возможностями для выделять большое количество белка. Trichoplusia Ni получены БТИ-TN-5B1-4 клеток (широко известный как High Five) имеют более высокую способность секреции и клеточная линия выбора для экспрессии в данном протоколе ^13,14. Кроме того, было бы полезно, чтобы уменьшить или даже устранить фетальной бычьей сыворотки (FBS) от выражения культур. Поэтому мы используем средства массовой информации с уменьшенным (3%) содержанием FBS для выращивания рабочие запасы вируса, и мы выполняем экспрессию белка в сыворотке крови свободных СМИ.

Рекомбинантные HA и NA белки используются для многих иммунологических методов. Пожалуй, наиболее распространенным является в ИФА для измерения преобразование сыворотки после вакцинации у людей или животных ^4,6,7,15. ГК и НАН также используются в ELISPOT анализов как оба стимулирующих молекул и реагентов обнаружения для антител секреции клеток ^16. Их использование в качестве молекулярных приманки позволяет конкретно сортировки для plasmablasts или других типов В-клеток, которые затем могут быть использованы для выделения (терапевтических) моноклональные антитела (моноклональные антитела). Рекомбинантные HA и NA молекулы в дальнейшем используются в характеристике этих МКА ^8. Другие примеры включают исследования устойчивости рН или рецептора специфику выразил различными изолятов вируса, или количественно оценки конкретных ферментативных NAдеятельность или устойчивость к ингибиторам. Кроме того, рекомбинантный очищенный HA может быть использован, чтобы стандартизировать содержание НА вируса гриппа инактивированных вакцин.

Важно отметить, что Rha (и в определенной степени NA) вакцин-кандидатов в настоящее время испытываются на животных моделях и клинических испытаниях на людях с одним кандидатом вакцин, лицензию FDA в 2013 году ^2,17-19. Преимущество этих новых вакцин является то, что, в связи с рекомбинантной природе этих белков, трудоемкий процесс генерирования высоких роста реассортантных вирусов можно было бы избежать. Возможно, еще более актуальным является то, что их доходность HA высока и воспроизводится от штамма к штамму. Кроме того, поскольку эти вакцины производятся в системе без яиц, они не содержат белковые примеси, которые создают проблемы для лиц, страдающих аллергией яйцо.

Здесь мы выбрали, чтобы выразить белков HA и NA от двух изолятов романа китайской H7N9 вируса гриппа, A / Аньui/1/13 и A/Shanghai/1/13 ^20,21. Эти примеры своевременных, но описанный протокол может быть использован для экспрессии любого гриппа А и B НА или NA белков и может быть адаптирована, чтобы выразить любые другие секретируемые вирусных или клеточных белков. Тример или тетрамерные белки трансмембранные могут быть клонированы в кассетах экспрессии, используемых для НА и NA, соответственно. Тем не менее, наиболее растворимые секретируемые клеточные белки, как интерфероны, например, не нужен дополнительный домен для стабилизации и может быть выражена исключительно с С-концевой гексагистидиновой меткой.