ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus
Summary
כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.
Abstract
מערכת ביטוי baculovirus היא כלי רב עוצמה לביטוי של חלבונים רקומביננטיים. כאן אנו משתמשים בו כדי לייצר גרסאות בצורה נכונה מקופלות ומסוכרות של שפעת גליקופרוטאינים משטח וירוס – hemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA). כדוגמא, בחרנו חלבוני HA ו NA לידי ביטוי על ידי נגיף H7N9 הרומן שהתפתח לאחרונה בסין. עם זאת הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לחלבוני HA ו NA לידי ביטוי בכל שפעת אחרת וזני B וירוס. חלבונים רקומביננטיים HA (RHA) וNA (RNA) הם חומרים כימיים חשובים למבחנים חיסוניים כגון ELISPOT וELISA, וגם בשימוש רחב לסטנדרטיזציה חיסון, גילוי נוגדנים, בידוד ואפיון. יתר על כן, ניתן להשתמש במולקולות NA רקומביננטי למסך למעכבי מולקולה קטנות ושימושיים לאפיון של הפונקציה האנזימטית של NA, כמו גם רגישותו לתרופות אנטי. חלבוני HA רקומביננטי גם being נבדק כחיסונים ניסיוניים במודלים של בעלי חיים, וחיסון המבוסס על HA רקומביננטי היה מורשה לאחרונה על ידי ה-FDA לשימוש בבני אדם. השיטה שאנו מתארים כאן כדי לייצר את המולקולות הללו היא ישר קדימה ויכולה להקל על מחקר במעבדות שפעת, שכן הוא מאפשר לייצור כמויות הגדולות של חלבונים במהירות ובעלות נמוכה. למרות שכאן אנחנו מתמקדים בגליקופרוטאינים משטח וירוס שפעת, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לייצר חלבונים נגיפיים משטח וסלולריים אחרים.
Introduction
כתגובה ראשונה להופעתה האחרונה של זן רומן H7N9 שפעת וירוס בסין, רכשנו פלסמידים הנושאים את רצפי הגנום לhemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA) הגנים של שני הבידודים הראשונים. שימוש בפלסמידים אלה היינו יכול לבנות במהירות וקטורי ביטוי baculoviral לייצור של HA רקומביננטי ו NA בתאי חרקים. מערכת ביטוי זה מבוסס היטב במעבדה שלנו והוכיחה מרכזי לרבים מהפרויקטים של המחקר המתמשך שלנו 1-8. תאי חרקים יכולים לקפל בצורה נכונה ושלאחר translationally לשנות חלבונים מורכבים. שינויים אלה כוללים glycosylation N צמוד, וזה חשוב עבור רבים גליקופרוטאינים נגיפיים. ככזה, אין זה מפתיע כי מערכת baculovirus היא די הוקמו להבעת פני השטח אנטיגנים נגיף שפעת. למעשה, רבים של מבני גבישי HA ו NA היה לפתור באמצעות חלבוני תא הביע חרקים 9-11. יתרון נוסף שלמערכת נמצאת בתשואות גבוהה החלבון אמין שלה של עד 30 מ"ג של תרבית תאי HA / L (המבוססת על הניסיון שלנו עם יותר מ -50 חלבונים שונים HA) – תוצאה של ביטוי זיהום בנגיף מונע מאמרגן polyhedrin החזק.
הסרת הטרנסממברני וendodomain של חלבוני HA ו NA מאפשרת ביטוי של גרסאות secretable, מסיסה של החלבונים ובכך מאוד מקל על תהליך הטיהור. בנוסף, ectodomains אלה hexahistidine מתויג ולכן יכול להיות מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה באמצעות Ni 2 + שרף. תחומים הטרנסממברני של חלבוני HA ו NA לתרום לhomotrimer והיווצרות homotetramer, בהתאמה. על מנת לשמר oligomerizations אלה, אנו להוסיף תחום trimerization טרמינל C-לHA-, ותחום tetramerization N-המסוף לNA הבונה (איור 1). יש לנו הראינו בוודאות כי תחום כגון trimerization מייצב פונקציונליות, ותוצאותrved אפיטופים קונפורמציה על גבעול תחום של 1 HA. Tetramerization הנכון של NA עשוי גם לתרום לתיקון מתקפל וNA פונקציה 10. ניתן לבקש רצפים ווקטורי baculo העברת מחסה תחומים trimerization או tetramerization מהמחברים או ממעבדות אחרות בתחום, 9,10,12.
נושא חשוב נוסף לביטוי של חלבונים מופרשים בתאי חרקים הוא הבחירה של שורת התאים תקין. בעוד frugiperda Spodoptera נגזר תאי Sf9 לתמוך שכפול baculovirus טוב מאוד ומשמשים בדרך כלל להצלת וירוס והתפשטות, יש להם היכולת להפריש כמויות גדולות של חלבון מוגבל. Trichoplusia ni נגזר BTI-TN-5B1-4 תאים (הידוע בהכינוי גבוה חמש) יש יכולת הפרשה גבוהה יותר ונמצא שורת התאים של בחירה לביטוי בפרוטוקול זה 13,14. יתר על כן, כדאי להפחית או אפילו להסיר את סרום שור העובר (FBS) מתרבויות ביטוי. לפיכך, אנו משתמשים במדיה עם מופחת (3%) תוכן FBS לגידול המניות עובדות וירוס, ואנו מבצעים את ביטוי החלבון בתקשורת חופשית בסרום.
חלבוני HA ו NA רקומביננטי משמשים עבור רבים טכניקות החיסוניות. אולי אחד הנפוץ ביותר הוא במבחני ELISA למדידת המרה בסרום על חיסון בבני אדם או בעלי חיים 4,6,7,15. יש וNAS משמשים גם במבחני ELISPOT כשתי מולקולות של גירוי וריאגנטים לזיהוי תאי מפרישי נוגדנים 16. השימוש בם כפיתיונות מולקולריים מאפשר במיוחד כדי למיין עבור plasmablasts או סוגים אחרים של B-תאים שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבודד נוגדנים (טיפוליים) חד שבטיים (מבז). מולקולות HA ו NA רקומביננטי משמשות עוד באפיון של בז אלה 8. דוגמאות אחרות כוללות ללמוד את יציבות pH או סגוליות של קולט הביע ידי מבודד וירוס שונה, או אנזימטי NA ספציפי כמותית הערכהפעילות או התנגדות למעכבים. יתר על כן, רקומביננטי, HA מטוהר יכול לשמש כדי לתקנן תוכן HA של חיסוני נגיף שפעת מומתים.
חשוב לציין, RHA (ובמידה מסוימת NA) מועמדי חיסון נמצאים כעת נבדקו במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים בבני אדם עם חיסון מועמד אחד שמורשה על ידי ה-FDA בשנת 2013 2,17-19. היתרון של חיסונים אלה רומן הוא כי, בשל האופי רקומביננטי של חלבונים אלו, ניתן למנוע את תהליך העבודה האינטנסיבית של יצירת של וירוסי reassortant צמיחה גבוהים. אולי אפילו יותר רלוונטי היא העובדה שתשואת HA שלהם היא גבוהה ולשעתק מזן לזן. כמו כן, מאחר חיסונים אלה מיוצרים במערכת חופשית ביצה, הם אינם מכילים חומרים מזהמים חלבון זה הם בעייתיים עבור אנשים עם אלרגיות לביצה.
כאן בחרנו להביע את חלבוני HA ו NA משני בידודים של נגיף הרומן הסיני H7N9 השפעת, / Anhui/1/13 וA/Shanghai/1/13 20,21. אלו הן דוגמאות בזמן, אבל הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לביטוי של כל שפעת וחלבונים B HA או NA וניתן להתאים להביע כל חלבונים נגיפיים או סלולריים מופרשים אחרים. ניתן לשכפל חלבונים הטרנסממברני trimeric או tetrameric לקלטות ביטוי המשמשות לHA ו NA, בהתאמה. עם זאת, חלבונים תאיים מופרשים המסיסים ביותר, כמו האינטרפרונים לדוגמא, לא צריכים תחום נוסף לייצוב ויכולים לבוא לידי ביטוי אך ורק עם תג hexahistidine C-מסוף.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שהביטוי של חלבוני HA ו NA נגיף שפעת בתאי חרקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus הוא ישר קדימה, בדרך כלל, יש כמה נקודות חשובים שיש לשקול. זה חשוב, כפי שציין בהקדמה, שectodomains של HA ו NA באים לידי ביטוי בשילוב עם תחומים trimerization או tetramerization, בהתאמה. תחומים אלה מבטיחים קיפול נכון של …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לפטריק ג וילסון לCR9114 נוגדן חד שבטי. אנו מודים גם ג'ניפר Debeauchamp וריצ'רד Webby לפלסמידים A/Anhui/1/13 המקוריים. תמיכה חלקית עבור עבודה זו סופקה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות במימון תכנית פרויקט גרנט AI097092-01A1 וCEIRS (מרכזים המצוינים למחקר שפעת ומעקבים, HHSN26620070010C). FK נתמכה על ידי מלגת ארווין שרדינגר (J 3232) מקרן המדע האוסטרית (FWF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
Riferimenti
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
