הפרדה אוטומטית של<em> ג elegans</em> יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

מיון תולעת אוטומטי הוא הרבה יותר כמו FACS, הפועל על ידי מדידת אות ניאון בתולעת (הניתנת בדרך כלל על ידי ביטוי של חלבונים מהונדסים כתב) כשהוא עובר יישר בצינור, המאפשר ניתוב מחדש או לצינור איסוף / טוב או למכל פסולת על פי לgating פרמטרים שנקבעו על ידי החוקר ^1. Wormsorter יכול להקל על מחקר בדרכים רבות; דוגמא להעסקתו ככלי אנליטי היא מחקר שבא בעקבות דפוסי spatiotemporal פעילות אמרגן לכמעט 1,000 גנים ^2.
עם זאת, השימוש העיקרי של wormsorter הוא במסכים גנטיים, בעקבות רמות יעד גן הביטוי או לוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי לאורך הציר של התולעת ^3-5.

כאן, אנו מתארים יישום חדש לwormsorter, בבעקבות הקולוניזציה של התולעת על ידי פתוגן מתויג fluorescently. עם זה ככלי שאנחנו מתמקדים במערכת היחסים בין pathogen קולוניזציה / עומס ואת התגובה החיסונית, כדי לקבל תובנות חדשות על המנגנונים אחראים לייזום של מערכת החיסונית בתולעת.

כמעט בכל היצורים שנחקרו עד כה, ייזום של תגובה חיסונית מולדת לחיידקי גורמי מחלה תלוי בהכרה של דפוסים הקשורים לפתוגן המולקולריים (PAMPs), ו / או דפוסים מולקולריים סכנה / הקשורים לנזק (damps) ^6,7. המבנים הראשונים שמורים של חיידקים הכוללים רכיבים של קיר חיידקי התא, השוטון שלו, או bilayer השומנים שלה ^6; השני, כוללים שני מולקולות שפורסמו (למשל ה-ATP ^8), חלבונים שונים או סמנים אחרים של תהליכים תאיים שינו ^9,10. שני סוגי האותות מוכרים על ידי חלבונים המיועדים כקולטניים זיהוי תבניות (PRRs), שעליו ספציפי מחייב של מולקולת דפוס להפעיל את שרשרת האירועים שהובילו לתגובה המגנה. ג elegans כבר מאוד שימושי כמו tractaמודל ble לנתח היבטים שונים של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן, אבל דבר אחד שאינו מובן היטב הוא איך תגובות חיסוניים הם יזמו בתולעת. אף אחד מהקולטנים המשוערת שorthologous לקולטנים זיהוי תבניות (PRRs) באורגניזמים אחרים הוכחו לאגד PAMPs, ורבים מorthologs של PRRs שהם מרכזיים לתגובות חיסוניים באורגניזמים אחרים להראות תרומה מוגבלת באופן מפתיע לתגובות הפתוגן התולעת והתנגדות. לדוגמא, קולט דרוזופילה האגרה, שהוא חיוני להתנגדות פתוגנים גראם חיוביים, מיוצג בג elegans ידי homolog בלעדי, tol-1, אשר תורם להגנה מפני הפתוגן השלילי גרם סלמונלה ¹¹ Typhimurium, אבל לא מגורמי מחלה אחרות שנבדקו גראם שליליות, או חיובית ^11,12. תצפיות אלו, בשילוב עם נתונים המצביע על כך תגובה חיסונית יכול להיגרם על ידי שיבוש שעות תרגום חלבונים תאייםכהוביל כמה להציע כי ג elegans מזהה בעיקר damps ^9,13,14. עם זאת, דיווחים המתארים את היכולת של פתוגנים מתים כדי לעורר תגובות חיסוניים מראים כי PAMP מחייב ניתן יש תפקיד חשוב בזיהוי הפתוגן בג elegans ^15,16. עבודה קודמת מתמקדת בתגובות חיסונית בג הזהה מבחינה גנטית מסונכרן גיל elegans אוכלוסיות, הפגינו השתנות בודדת גדולה בקולוניזציה במעי על ידי פתוגן החיידקים גראם שלילי Pseudomonas aeruginosa.

עם זאת, מחקרי פרופיל תעתיק טופלו אוכלוסיות variably-יישבו אלה כישות אחת ^17,18. ניצול של השונות הזאת, פיתחנו פרוטוקול תוך התמקדות wormsorter אוטומטי להפריד אוכלוסיות יישבו באופן דיפרנציאלי של elegans Caenorhabditis נחשף לפ-GFP-לבטא aeruginosa. בדיקת ביטוי גנים באוכלוסיות שונה, יישבו faciהערכת litated של הקשר בין עומס הפתוגן (והנזק קשור) ואת התגובה חיסונית ותובנות חדשות הניתנות על הכרת הפתוגן בג elegans ^19. להלן נתאר את הפרוטוקול, אשר יכול להיות מיושם כדי למיין תולעים נגועים בפתוגן כל שכותרתו fluorescently.

למשתמשים פוטנציאליים יש לציין כי מספר התולעים נדרשו להיות מיינו תלוי באופי של הניתוחים שלאחר מכן ופרוטוקולים שבשימוש. לדוגמא, במקרה של ניתוח ביטוי גני microarray,> 1,000 תולעים יידרשו להשיג מספיק RNA, אם פרוטוקולים סטנדרטיים משמשים, אבל ~ 100 תולעים יספיקו אם הגברה היא מועסקות, המאפשרים איסוף מהיר של חומר ובכך למזער את הלחץ על התולעים.