Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto
Summary
Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto.
Abstract
Anteriormente, los estudios electrofisiológicos en adultos de pez cebra se han limitado a cortar los preparados o de preparación para la Copa del ojo y grabaciones electrorentinogram. Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos, lo que permite la grabación de la actividad neuronal. Inmovilización del adulto requiere un mecanismo para entregar el oxígeno disuelto de las branquias en lugar del movimiento bucal y opercular. Con nuestra técnica, los animales se inmovilizan y perfundidos con agua hábitat para cumplir con este requisito. Una craneotomía se realiza bajo tricaína metanosulfonato (MS-222; tricaína) anestesia para facilitar el acceso al cerebro. El electrodo primario se coloca entonces dentro de la ventana de craneotomía para registrar la actividad cerebral extracelular. A través del uso de un sistema de perfusión de haces tubulares, una variedad de compuestos farmacológicos se puede administrar a los peces adultos y cualquier alteración en la actividad neuralse puede observar. La metodología no sólo permite observaciones que se hagan con respecto a cambios en la actividad neurológica, sino que también permite que se hagan comparaciones entre las larvas y adultos de pez cebra. Esto da a los investigadores la capacidad de identificar las alteraciones en la actividad neurológica debido a la introducción de diversos compuestos en diferentes etapas de la vida.
Introduction
En este artículo, un protocolo se describe para la obtención de grabaciones in vivo de la actividad neuronal en adultos de pez cebra. Se utilizan métodos de registro extracelular, proporcionando mediciones de voltaje de actividad eléctrica dentro de una pequeña región de tejido neural. Este método de investigación implica el seguimiento de un gran número de células en un animal de comportarse 1. Anteriormente, las grabaciones de división se han realizado en adultos y larvas, como lo han hecho los preparativos de la taza del ojo y grabaciones electrorretinograma. Estos experimentos se han realizado en gran medida al detalle las respuestas fisiológicas de diferentes sistemas sensoriales 2-5. Hasta hace poco, los preparativos cerebrales intactas sólo han estado disponibles para la realización de electrofisiología con 3,6,7 larva de pez cebra, que se puede producir la difusión de la respiración y el oxígeno a través de la piel. Nuestra preparación permite que la actividad neurológica nativa de un pez cebra adulto a medir mientras el animal sigue siendo plenamente consciente y consciente of sus alrededores.
El pez cebra (Danio rerio) actualmente juegan un papel fundamental como modelo para estudios genéticos, toxicológicos, farmacológicos y fisiopatológicos 3. El pez cebra se han ganado visibilidad en el campo de la neurociencia, ya que comparten una amplia similitud con los mamíferos a nivel genético, neurales y endocrinas niveles 8. Durante la última década, las técnicas neuroanatómicas y inmunohistoquímicos estándar se han utilizado para determinar la organización característica detallada del sistema nervioso pez cebra 9-12 y de la distribución de los diferentes neurotransmisores 3,8,13. Más recientemente, los investigadores han cambiado su enfoque a los estudios funcionales 14,15, muchos de los cuales se centran en los procesos conductuales 16-19 y características electrofisiológicas de los sistemas sensoriales 2,13,20. Un pequeño número de estos estudios se han concentrado en la actividad eléctrica de las áreas específicas del adult cerebro del pez cebra 21-23, pero no se llevaron a cabo utilizando un enfoque in vivo.
Este protocolo puede ser adaptado para estudios electrofisiológicos de tanto la actividad espontánea y evocada dentro del sistema nervioso pez cebra para describir los patrones de actividad en regiones específicas del cerebro. El uso de esta técnica permite que se hagan comparaciones entre la actividad neurológica de los estadios larvales y adultos jóvenes. Además, nuestro protocolo permite comparaciones entre alteraciones genéticas o farmacológicas. Junto con otros enfoques, como la ingeniería genética o pruebas farmacológicas, este método ofrece una nueva posibilidad para el análisis funcional de la comunicación neuronal y la plasticidad en el adulto animal intacto, así como para las aplicaciones potenciales, tales como el estudio de la epilepsia de inicio tardío o los procesos neurodegenerativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se ha usado para medir la actividad neuronal de adultos de pez cebra en vivo. Con la práctica, la actividad neuronal se puede observar constantemente, a pesar de las características (amplitud y la forma de eventos) de la actividad registrada pueden variar entre los peces. La utilización de la técnica de grabación extracelular puede explicar esta observación. El método proporciona control simultáneo de un gran número de células dentro de una región 1, por lo que las variacion…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH / NINDS subvención R01NS070159 (a TMD, JDL y ATS).
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
Riferimenti
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscienze. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. . Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. . Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
