长鼻扩展响应协议为侦查行为可塑性的昆虫：应用基础，生物医学和农业研究

1，气味（条件刺激）墨盒安装在实验中，设置多个气味盒所有需要的调节试验的不同气味的开始。 使用通风柜的气味稀释和气味盒准备。从未公开的瓶子通风柜以外的气味，由于气味将整个实验室迅速扩散和潜在的调节之前暴露的蜜蜂的气味。此外，戴手套而设立的气味和墨盒彻底清洗之后，以避免造成蜜蜂对气味在处理它们。 确保每个气味盒标明了它第一次使用气味的彩色编码标签。从未超过一个气味使用气味盒（注射器筒或柱塞），因为可能会出现卡盒上的残余气味。 准备异味和气味的混合物稀释在任己烷或矿物油的气味对desired浓度。 注：改变气味的浓度或呈现两种或更多种的加臭剂的混合物可允许的附加方面调查如何蜜蜂感知的气味和学习的条件相关联。气味混合物可以很简单，比如50:50的二元混合物或复杂如一些气味，模仿自然的嗅觉刺激。减少气味的浓度也增加了工作的难度。 气味会变得枯竭与重用的墨盒（ 图2）。为了避免损耗的问题作出足够的墨盒，能够切换到一个新的墨盒每次10-12用途。 准备气味墨盒方法1 对于这种方法，使用20个毫升的塑料注射器用的滤纸15毫米直径的圆钉扎到柱塞的气味墨盒的橡胶末端。 从注射器取出活塞，用图钉来连接件滤清器的ř纸到冲头的端部。 用微量放置10微升的气味到滤纸上，然后重新插入柱塞入注射器筒。推动柱塞，以15 ml刻度上的注射器管。 方法2 对于这种方法，使用1毫升的玻璃或塑料的结核菌素注射器（或类似的体积和形状的改性移液器）与滤纸条内部和橡胶或硅酮限制器在注射器管的气味墨盒的宽端。 取出从1毫升的结核菌素注射器筒的柱塞。注射器管将是气味盒的主体。 除去从针筒柱塞的黑色橡胶塞尖和切断的橡胶末端的封闭端。 注：此橡胶圈将作为一个限制器，以减少吸入的气流在赛场上，这将过早地画出来的气味盒及以上的内敛蜜蜂。另外，硅胶管（4.8毫米欧特ř直径）切成5毫米部分工作为限。 冲洗注射器筒和橡胶/硅限制器，用70％乙醇的内侧（以除去多从以前使用的剩余气味的），并让它们风干。 放置滤纸0.2×4厘米的条插入筒的宽开口，从而在纸张延伸1-2厘米以外的开口。 使用微量吸移放置3-10微升的气味到滤纸而不让气味触摸注射器管的端部。枪头可重复使用相同的气味，但一定要使用新鲜的提示来设置下一个气味。 打开注射器管的宽开口向上，以便在滤纸滑动迅速进入管。插入节流到注射器筒的宽开口。 确保每个气味盒标明它首先用于气味的彩色编码标签。切勿使用气味盒（注射器管或restrictor）为一个以上的气味，因为可能会出现在其上残留的气味。 球一个不掉毛组织的结尾，用70％乙醇浸泡，并用它来彻底擦拭墨盒的外表面，以除去残留的气味在盒的外面。 2，收集，限制和饲养的蜜蜂准备蜂抑制线束进行简单的限制安全带的蜜蜂出塑料饮料吸管，硬质塑料管，或加工金属管（均为约0.9厘米内径，并有1-2毫米壁厚）。采用坚固的吊带涉及外科手术。 切管为3厘米的段。然后，部分地修剪掉大约一半的上1厘米线束的，使其更容易保持蜂到位而紧固的线束。 切胶带的0.2×6cm的条状，将其一端连接到蜂具，LEA的一面VING，另一端自由。 收集工人蜜蜂从入口到殖民地收集的工人，因为他们从殖民地出发前，暂停或因为他们从觅食回来。 注：将一块金属丝网，用孔足够大的工蜂爬行通过，在入口处放慢返回工人下来，使得它更容易捕捉到他们，他们进入殖民地之前。 将闪烁瓶中过蜜蜂，直到它飞了进去。保持其开放水平或朝下，而盖固定小瓶让蜜蜂飞不起来了小瓶的。将只在每个小瓶蜂。确保盖子上有个孔，以便有足够的气体交换。 收集蜜蜂迅速，尽量减少他们在瓶中花的时间。请在树荫下的小盒子，在这些蜜蜂的小瓶。 传输盒与瓶和蜜蜂的实验，并把小瓶入冰水SL厄里直到蜜蜂停止移动。一旦蜜蜂是不动的，从冰立刻取出小瓶，以避免过度暴露于寒冷，把蜜蜂变成限制安全带。 注意：我们不建议把蜜蜂在冰箱或冰柜，因为它是难以监控的时候，蜜蜂变得不动，导致过度暴露于寒冷。当利用10多蜜蜂，转让只有少数蜜蜂冰 – 水浆的时间。 抑制蜜蜂放置蜂在其背侧胸部朝向管道的切去部分和它的头部只是管子的顶部上面的线束。轻轻按压蜂靠近油管所以其口器延伸超过管子的边缘。滑动管道胶带的条带在头上的蜂的背侧胸部之间并牢固的自由端连接到线束的侧面。 确保对线束胶带光滑紧绷。不应该有任何的NotI蜂线束的前部和磁带，磁带之间ceable间隙应平躺在配线的顶端。如果有空白的蜂可能无法正确​​地延长其长鼻或者它可以逸出。此外，请确保蜜蜂的前腿没有线束的正面和胶带之间突出。 饲养蜜蜂的饲养，以调节区间约30分钟以下治理 – 后蜜蜂已经从初始设置回收 – 喂蜜蜂3-4微升0.5M的蔗糖（在水中）。这笔款项将足以满足3-4小时的喂养对调节间隔。 在一般情况下，进料加入1μl0.5M的蔗糖为约每小时的喂养和调理之间的等待时间，以确保蜜蜂生存区间却是足够只在空调开始时被激励的学习条件关联。在实验室保持在一个温暖的温度，如果u唱不同浓度的蔗糖，调整供给量或时间间隔相应。 注：由于进料的24小时空调的时间间隔，确保所有的蜜蜂都吃饱了0.5或1M蔗糖至少24小时之前，空调就开始了。在室温下，蜜蜂大约需要24小时，他们的动机是前足的调理方案反应良好。 注意：使用的蔗糖溶液的浓度较低的进料蜜蜂比调节过程中使用作为奖励，以防止蜜蜂成为蔗糖的调节过程中所用的浓度，这可以减少学习表现18较不敏感的浓度。 喂蜜蜂在一个地区远离训练场。暴露于非条件刺激（蔗糖）中调理前调理上下文可能影响后续调理的气味。 在喂养和C之间的间隔onditioning放在台面上的蜜蜂在实验室的一个安静的区域，以避免不必要的干扰。如果实验室具有低的环境湿度，放置在与湿纸巾的塑料容器的蜜蜂的时间间隔期间。这可以防止脱水，因为当它们暴露于低湿度下长时间周期蜜蜂可能死亡。 注意：不要在实验中改变了治理和喂养方案！使用设置和饲养蜜蜂和开始调理为每次实验，以便蜜蜂都处理过的完全相同的方式之间只有一个特定的时间间隔。 3，调理测试的蔗糖敏感性开始前调理几分钟，测试蜜蜂的动机通过触摸触角的小液滴0.5M的蔗糖溶液（饲养过程中使用的相同浓度）来养活。不要让他们在测试中进食。如果他们通过EXTE回应nding其长鼻了，它们可能充分地主动地学习和可用于该协议。 实验设计注：此协议可以进行修改，以适应学习协议繁多，以探讨蜜蜂的学习和记忆能力的诸多方面。在众多的参数可以被调整的是：间试用期，培养在给定的时间，刺激间间隔，类型和浓度以及气味，类型和非条件刺激的浓度，数量和序列的数目的蜜蜂数试验（ 图1，表1），19-21。当设计针对每个空调试验的精确协议，这是非常重要的，以保持不同个体一致的试验间隔。跨试用期太短，太长或不一致会影响蜜蜂的性能。看到讨论一个完整的治疗这个话题。 注：蜜蜂旨意更快，如果他们是在一个温暖的环境中学习的任务。因此，保持训练环境的一致性和温暖（29-30℃，如果可能的话）的温度。 交付的气味（条件刺激） 方法1 设置的气味传送系统装入塑料20毫升注射器装有气味处理的滤纸所以它是稳定的，小的一端朝向直接在蜂的触角。将柱塞在15毫升标记和定位注射器使柱塞方便使用。 呈现刺激的气味在每次试验开始时，将线束的蜜蜂在空调领域的联系汇率制度，其触角直接指着气味盒。让我们开始刺激的气味，以减少中断造成的气味刺激时其视觉环境的急剧变化前的蜜蜂适应竞技场15-25秒。如果蜂开始到气味盒后马上就被放置在调节竞技场响应，可能有异味在盒的前端。用不起毛的组织浸泡在70％酒精清洗墨盒脱去污染的气味。如果不解决这个问题，请更换墨盒。 按注射器的柱塞以平稳的速度，以便将柱塞4秒钟内完全压下。显示器呈现无条件刺激之前，蜜蜂的回应气味。 在每次试验中，让蜜蜂在休息调理舞台另一15-25秒。移动蜜蜂太快了审判后会显著减少每个调节试验的有效性。 方法2 设置的气味传送系统气流源和流量作为源气流的气味传递用一个水族馆泵增氧机或实验室工作台上加压送风，如果实验室配备了它。 注：典型的鱼缸增氧机油泵将有近400个ml / min的气流速度（7毫升/秒）;在4秒的刺激气味，28毫升空气将流经1ml的墨盒。 用在线路的流量计与空气输送装置的管来调节流量的空气供给率。调整流量计直到流速为400毫升/分钟。检查流速在气味盒的一个单独的流量计的开口。 通过塑料管和阀门的系统连接的气流气味盒。 注：下面讨论的计时装置打开阀门在审判中适当的时间。塑料连接器通过鲁尔型连接到墨盒的注射器针筒装上通风系统异味盒。 无论气流源，定期检查流量马柯确保线完好无损，流速维持在所期望的速率。 自动除臭交付使用可编程逻辑控制器（PLC）来自动气味的传递。 注意：PLC编程，打开阀门的气味输送气流6秒启动程序（通过按下一个按钮启动）后，保持阀门打开，持续4秒，并发出声音信号喂养，通过一个小喇叭，后气味刺激发病3秒信号实验者提供蔗糖。 用一个小的LED指示每个审判期间的气味刺激的时机。如果可能的话使用红色LED，因为蜜蜂的光感受器是由长[红色]波长和较短的走向[紫外线]波长转移开来，使他们看不到它做好。定位LED背后的蜜蜂以下，他们的视野之外，所以光线不会成为一个无意的条件刺激。 注：LIGHT也有助于验证PLC工作正常，并在试验过程中试验分析蜜蜂的答复录像非常有用。 排气系统设立一个排气系统的蜜蜂后面，帮助拉风过去的蜜蜂和疏散气味载货空气从空调竞技场保持独立时间表的气味每个演示文稿。 注意：如果在实验室真空系统，修改真空口和连接机管路的管道，提供疏散调理舞台上所需要的气流。如果没有一个真空系统，小型电动风扇收纳在与干燥机的管线导致通风橱或通过窗户将是足够的。 在每一天的开始，检查气味输送系统和排气系统的电和空气连接。按气味输送系统上的启动按钮和跟踪按下的时间间隔按钮，当阀门打开（一个安静的点击和LED灯亮起），并在提示，目前的非条件刺激（蜂鸣声）的声音。通过将湿润的指尖在将要附着到气味盒中的连接器的前部检查空气输送。应该有一个强大的空气流，只有当阀门打开。通过举办无绒组织到排气系统的开放，以确保气流足够强大妥善疏散空气从空调领域的检查排气系统。 安装的气味盒放置一些橡皮泥无论是在柜台还是在一个小有机玻璃站到排气系统的正前方位置的蜜蜂和气味盒。将玻璃注射器的气味在粘土和调整，使开放在广角端对准蜜蜂的头。注射器的结束应该是1-2厘米的蜜蜂。接在该范围内的距离，并是恒定的。可靠地将墨盒连接到空气管和阀系统在注射器的窄毛玻璃端嵌合。 呈现刺激的气味在每次试验开始时，将驾驭蜜蜂在空调领域的联系汇率制度，其触角直接指着气味盒。开始的刺激气味，使它成为习惯新环境之前，让蜜蜂休息的舞台上15-25秒。 请注意：如果蜂开始被放置在调节舞台之后立即响应的气味盒，有可能是气味在盒的前端。用不起毛的组织浸泡在70％酒精清洗墨盒脱去污染的气味。如果不解决这个问题，请更换墨盒。 按下启动按钮来启动的气味传递的计时机制。监控蜂的回应后，刺激气味发病和演示非条件刺激前。 在每次试验中，让蜜蜂在休息调理舞台另一15-25秒，以允许初始记忆的形成。移动蜜蜂太快了审判后会显著减少每个调节试验的有效性。 交付的蔗糖（无条件刺激） 方法1 对于这种方法，用牙签交付的蔗糖。 注：最好用塑料牙签，因为牙签木能有一个气味会影响蜜蜂的反应条件刺激。 浸牙签的尖端进入蔗糖溶液，和，当它的时间来呈现非条件刺激，保持牙签在蜂的前面和允许蜂舔从牙签的蔗糖为约1秒。 定期更换牙签，避免苏建设crose。 方法2 蔗糖输送系统注：更准确的方法来实现非条件刺激是通过利用微米的注射器，它可以准确地提供少量的蔗糖奖励（一微升的十分之一）的。 风注射器的微米背面尽可能。加载微米注射器管的蔗糖溶液。确保有玻璃部分无气泡和组装的注射器。将其放置于注射器管的窄端之前填充的蔗糖溶液中的针的轮毂。为了确保在针的流体实际上是蔗糖，而不是水冲洗针，开始实验前风微米前进1-2微升。 蔗糖介绍持针从蜂约2厘米的前端，而气味的方法。使用训练场的边缘，以防止晃动注射器的运动可以分散的蜜蜂。不要让针太近预期喂养信号，因为这也将过早从气味蔗糖转移蜜蜂的注意。 只要喂养信号响起，轻轻触摸天线，直到蜜蜂扩展其长鼻，再喂蜜蜂。这应该只需要一个很轻的触摸或两个天线。 0.2和0.8μL之间使用的奖励金额。蜂应该容易消耗分配给非条件刺激（〜1-2秒）的时间周期内整个液滴。不要用“ 随意 ”，从一个大的液滴，使蜜蜂食几秒钟，但不能完全消耗喂养。 关注蔗糖天线，这将减少蜜蜂的回应奖励随后介绍的建立。修改喂养过程，如果发生这种情况。 保证了气味的精确配对提示和蔗糖的奖励，确保口气后，尽快提交的蔗糖溶液液滴的蜜蜂。 注：在CS（气味）和美国（蔗糖）的发作之间的时序是至关重要的。理想情况下，气味演示和蔗糖陈述应该简单地重叠。如果超过几秒钟的CS的端部和输送美国相隔，调理性能会减弱。 4，测试继空调使用非增强型测试试验，以评估如何做好蜜蜂教训和/或记住的空调协会。 注：请参阅讨论对蜜蜂的反应，无筋测试试验，除了蜜蜂在分析了空调性能的试验和测试试验和气味试验的一些目的解释的重要性的详细说明。 整理时间以下空调，无论是管理即时测试试验或让蜜蜂休息经过盘整期。 注：巩固期的长度，调节和测试之间的时间间隔，将取决于实验的目的。如果目的是考察学习差异或短期记忆，蜜蜂'的测试试验性能紧接或调理后几个小时进行评估。如果实验是研究长期记忆的测试试验，应至少提前24小时调理结束后。 如果测试试验超过24小时以下的空调，每天喂蜜蜂饱食与0.5M的蔗糖以下空调和至少一次之后，直到测试试验前12-24小时。 为了确保蜜蜂已经达到饱食，喂他们每个人的几个不同的时间，直到他们不再延长其长鼻响应触摸自己的天线e为蔗糖。他们可以消耗高达40微升，达到饱食。 让蜜蜂在湿润的容器中，以防止在整顿期间的干燥剂和死亡。 测试试验测试只能使用新制备的气味墨盒。 请注意：用于采集该墨盒可差动耗尽，所以测试刺激将不会在试验中，气味，和个人蜜蜂一致，因此，可以显著影响结果的一致性和稳定性。 在测试过程中，如在实验的调理阶段使用维持相同的试验间隔等参数。 在测试试验中不存在非条件刺激，由于奖励的存在将改变蜜蜂的响应条件刺激，潜在地掩蔽调理协议或治疗的更微妙的影响。 所有的纪录影片ØF表示测试试验，以便能够在以后测量多个方面蜜蜂的反应气味（S）。 5，记录蜜蜂的回应二进制（有/无）市盈率的评分在空调试验和测试过程中使用的试验每一个二进制评分系统。得分为正或负的反应;这是令人满意的多种分析用的每个处理组20-40蜜蜂的样本大小。的响应的精确拓扑结构可能是复杂的22。它建立了一个易于看到和评分标准进行了积极的响应是很重要的。 分数蜜蜂的反应为阳性（+），当蜜蜂扩展其长鼻超出连接打开的下颌骨的提示做就行了。只有进球了积极的回应，当蜜蜂的气味后发病，但气味抵消之前扩大其长鼻。 分数蜜蜂的反应为阴性（ – ）时，有没有Ë军事攻略或者如果长鼻时的加臭剂的偏移后延长试用期间长鼻的。 不要试图将比分局部反应。为了使更精细的区分，在蜜蜂的行为，请使用下面介绍的视频分析技术。 附加PER测量视频分析（ 电影1） 通过分析蜜蜂的回应视频，气味搜集行为测试的更多信息。 请注意：这些测量也可以提供更高的时间分辨率为检查蜜蜂的响应的气味，特别是当没有在PER的治疗组之间存在/不存在评分的差。 录制视频请务必使用未增强测试或灭绝试验的录像。奖励的存在将改变蜜蜂的响应于气味，修改长鼻持续时间延长。 设置一台摄像机以上的训练场三脚架和集中在相机上蜜蜂的头前，让触角和喙是大家关注的焦点。 定位小的LED灯，其指示气味刺激呈现，在蜂后面的区域是可见的视频，以便用它来识别气味发病和分析过程中的偏移量。 开始录制的气味发作前20秒，并继续记录至少20秒后，异味扰民蜜蜂前偏移。 视频分析上传视频到视频编辑软件，如iMovie中或Final Cut Pro中，以测量在特定的视频帧之间的时间间隔的能力。 分析蜜蜂的响应气味为开始于刺激的气味（ 例如 ，10或20秒）的发作的离散时间周期。 使用评估按照以下常见的测量： 测量持续时间长鼻延伸，这是该长鼻延伸超出下颚到颌骨线（上述）的总时间的。 注：蜜蜂可扩展和10-20秒的时间窗内收回其长鼻多次。单独测量每个长鼻延伸，并计算出总的持续时间。分析每个个别长鼻延伸的数目和持续时间也可以提供有价值的信息。 测量长鼻延伸，它是气味发作之间的时间，在LED灯亮，并且第一长鼻扩展的延迟。 计数和时间舌扩展相对于发病的加臭剂的，第一延伸，或其他时序参数。 跟踪触角运动23，这也显示出特有的气味为导向的变化。 注意：在电影1，触角运动已经被跟踪视频跟踪软件来说明触角运动的改变IN响应一个刺激气味。