Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em> Listeria monocytogenes</em

A bactéria Gram positiva Listeria monocytogenes é um agente patogénico de origem alimentar que invade células hospedeiras, interrompe a sua internalização vacúolo e replica-se no citoplasma das células hospedeiras ^1. L. monocytogenes facilidade de manipulação no âmbito de laboratório (crescimento rápido, uma baixa toxicidade para os indivíduos saudáveis) associada à persistência de traços de virulência da bactéria observadas em modelos celulares e animais (actividade hemolítica, leucocitose) permitiu o seu uso inicial em 1960 como um modelo para a maior o estudo do parasitismo intracelular e para o estabelecimento dos fundamentos teóricos da imunidade celular contra a infecção ^2. No final de 1980 e início de 1990, a dissecação do ciclo intracelular bacteriana ^3, bem como a caracterização molecular da virulência bacteriana mais importante fatores ^4-7 favoreceu o uso de L. monocytogenes como ferramenta molecular chave para a manipulação e cravoy de funções da célula hospedeira. A presença de avirulent (L. innocua) e (L. monocytogenes) espécies virulentas do gênero Listeria pavimentou o caminho para estudos genômicos comparativos ⁸ que, juntamente com a recente criação da L. completo monocytogenes transcriptoma ^9, aumentamos nossa compreensão da evolução de L. Listeria como um patogénico humano e como um sistema modelo para estudos de infecção ^{de 10.}

L. monocytogenes induz sua internalização em células hospedeiras após a interação das proteínas da superfície bacteriana inla e inlB com seus receptores da célula hospedeira E-caderina e MET, respectivamente ^11-12. Estudos de base candidata inicial levou à identificação de uma ligação cateninas-actina α / β como um componente significativo da via ^inla-13 e invasão da fosfoinositida 3-quinase (PI 3-K) como um efector crucial do inlB- dependente casca invasãode ^14-15. Ensaios de proteômica e baseados em funcional, posteriormente, permitiu a identificação de novos elementos do citoesqueleto ¹⁶ e lipídios segundos mensageiros ¹⁷ necessários para a invasão da célula hospedeira. Estudos de transcrição ¹⁸ e proteômica baseada em espectrometria de massa quantitativos ¹⁹ lançaram recentemente uma nova luz sobre a ativação da sinalização de acolhimento cascatas ea repressão da resposta imune durante L. monocytogenes infecção. Biologia de sistemas abordagens baseadas na inativação de grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeno RNA de interferência (siRNA) silenciamento abriram recentemente novos caminhos para a análise do acolhimento global de cascatas de sinalização no contexto de funções celulares específicas, incluindo a fagocitose e patógeno internalização ^20. Telas siRNA Genome-wide foram previamente realizados para investigar cascatas celulares necessários para a infecção de L. monocytogenes em fagocitária Drosophila </em> ^21-22 células S2, mas este tipo de análise não foi realizada em células não fagocíticas, que representam alvos importantes para a infecção in vivo.

Nós otimizamos um protocolo para a detecção microscópica dos estágios finais da infecção por L. monocytogenes, que é adequada para estudos de alta produtividade siRNA de entrada de bactérias no interior das células epiteliais. Nosso ensaio se aproveita de uma L. altamente invasivo monocytogenes cepa que apresenta uma mutação pontual na PrfA, o principal regulador da transcrição de L. monocytogenes virulência ^6: esta mutação (chamado PrfA *) torna PrfA constitutivamente activa ²³ e conduz a um aumento da expressão das proteínas de invasão inla inlB e, portanto, favorecer a entrada de bactérias em células não fagocíticas outro modo mal infectados. A nossa leitura de infecção baseia-se na detecção da acumulação citosólica do inLC proteína bacteriana segregada: esta molécula éum efector pleiotrópico que é expressa preferencialmente pelas intra-citoplasmático L. monocytogenes ⁹ e que não só participa na célula-a-célula bacteriana espalhar ^24, mas que também modula as respostas imunitárias do hospedeiro ^25. A marcação fluorescente de secreção inLC por bactérias intracelulares não só permite distinguir claramente infectada a partir de células não-infectadas, mas também representa uma leitura de ponto final que pode ser usada para dissecar posteriormente infecção em suas diferentes etapas: entrada, escape vacuolar, citosólica bacteriana proliferação e disseminação célula-a-célula. Este protocolo baseado em microscopia pode ser acoplado a telas de siRNA, por conseguinte, para estudar vias celulares envolvidas na infecção de células hospedeiras por L. monocytogenes.