Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em> Listeria monocytogenes</em
Summary
Listeria monocytogenes è un batterio patogeno Gram positivi frequentemente usato come modello importante per lo studio di parassitismo intracellulare. Imaging tardi L. monocytogenes fasi di infezione nel contesto di schermi piccole interferenti RNA permette per lo studio globale di vie cellulari necessarie per infezione batterica delle cellule ospiti bersaglio.
Abstract
Patogeni intracellulari batteriche possono essere concepite come strumenti molecolari per sezionare cascate di segnalazione cellulare a causa della loro capacità di manipolare squisitamente e sovvertire le funzioni cellulari che sono necessarie per l'infezione dei tessuti bersaglio ospitanti. Tra questi batteri patogeni, Listeria monocytogenes è un microrganismo Gram positivo che è stato usato come paradigma per parassitismo intracellulare nella caratterizzazione delle risposte immunitarie cellulari, e che ha avuto un ruolo strumentale nella scoperta di percorsi molecolari che controllano citoscheletro e membrana dinamiche di traffico. In questo articolo descriviamo un saggio microscopica robusto per l'individuazione di fasi tardive infezione cellulare di L. monocytogenes basano sulla marcatura fluorescente di InlC, una proteina batterica secreto che si accumula nel citoplasma delle cellule infette; questo dosaggio può essere accoppiato ad alto throughput schermi piccoli RNA interferenti automatizzati per charziazioni che caratterizzano vie di segnalazione cellulari coinvolti nella up o down-regulation di infezione.
Introduction
Il batterio Gram positivi Listeria monocytogenes è un patogeno di origine alimentare che invade cellule ospiti, interrompe la sua vacuolo interiorizzazione e replica nel citoplasma delle cellule ospiti 1. L. monocytogenes facilità di manipolazione nel contesto laboratorio (rapida crescita, bassa tossicità per gli individui sani) associato con la persistenza di tratti di virulenza batterica osservati nei modelli cellulari e animali (attività emolitica, leucocitosi) ha permesso l'uso iniziale nel 1960 come un modello importante per lo studio del parassitismo intracellulare e per l'istituzione dei fondamenti teorici della immunità cellulare contro l'infezione 2. Alla fine del 1980 e all'inizio del 1990, la dissezione del ciclo intracellulare batterica 3, nonché la caratterizzazione molecolare dei più importanti fattori di virulenza batterica 4-7 favorito l'uso di L. monocytogenes come strumento molecolare fondamentale per la manipolazione e studY di funzioni della cellula ospite. La presenza di virulenti (L. innocua) e virulenti (L. monocytogenes) specie del genere Listeria aperto la strada a studi di genomica comparativa 8 che, assieme alla recente istituzione del completo L. monocytogenes trascrittoma 9, hanno aumentato la nostra comprensione dell'evoluzione del L. monocytogenes come agente patogeno umano e come sistema modello per l'infezione Studi 10.
L. monocytogenes induce la sua internalizzazione nelle cellule ospiti su interazione delle proteine di superficie batterica dell'INLA e InlB con i loro recettori della cellula ospite E-caderina e Met, rispettivamente, 11-12. Studi basati candidati-iniziali hanno portato all'identificazione del collegamento catenine-actina α / β come componente significativa del percorso inlA-invasione 13 e del phosphoinositide 3-chinasi (PI 3-K) come effettore critica del InlB- dipendente invasione Cascade 14-15. Analisi proteomica e basati funzionale successivamente consentito l'identificazione degli elementi del citoscheletro nuovi 16 e secondi messaggeri lipidici 17 necessari per l'invasione della cellula ospite. Studi trascrizionali 18 e di massa a base di spettrometria di proteomica quantitativa 19 hanno recentemente gettato nuova luce concernente l'attivazione di accoglienza cascate di segnalazione e la repressione delle risposte immunitarie durante L. monocytogenes infezione. La biologia dei sistemi si avvicina basato sulla inattivazione di grandi insiemi di geni (kinomes, genomi completi) da piccoli RNA interferenti (siRNA) silenziamento hanno recentemente aperto nuove strade per l'analisi di accoglienza globale cascate di segnalazione nel contesto di specifiche funzioni cellulari, tra cui la fagocitosi e patogeno interiorizzazione 20. Schermi siRNA genome-wide sono stati precedentemente eseguiti per studiare cascate cellulari necessarie per l'infezione di L. monocytogenes in phagocytic Drosophila </em> cellule S2 21-22, ma questo tipo di analisi non è stata eseguita in cellule non fagocitarie, che rappresentano bersagli critici per l'infezione in vivo.
Abbiamo ottimizzato un protocollo per la rilevazione microscopica delle ultime fasi di infezione da L. monocytogenes che è adatto per gli studi high-throughput siRNA di entrata batterica all'interno delle cellule epiteliali. La nostra analisi si avvale di una L. altamente invasiva monocytogenes che presenta una mutazione puntiforme nel PrfA, il regolatore trascrizionale maggiore di L. monocytogenes fattori di virulenza 6: questa mutazione (denominata PrfA *) rende PrfA costitutivamente attivo 23 e porta ad un aumento dell'espressione delle proteine invasione dell'INLA e InlB, quindi favorendo l'ingresso di batteri in cellule non fagocitarie altrimenti poco infetti. La nostra lettura di infezione si basa sulla rilevazione dell'accumulo citosolica della proteina secreta batterica InlC: questa molecola èun effettore pleiotropici che si esprime preferenzialmente da intra-citoplasmatica L. monocytogenes 9 e che partecipa non solo nella cella cellula-batterica distribuite 24, ma che modula anche la risposta immunitaria 25. La marcatura fluorescente di InlC secrezione da batteri intracellulari permette non solo di distinguere chiaramente infetto da cellule non infette, ma rappresenta anche una lettura end-point che può essere utilizzato per analizzare successivamente infezione nelle sue diverse fasi: entrata, fuga vacuolare, citosolica batterica proliferazione e diffusione cellula-cellula. Questo protocollo basato microscopia può essere accoppiato a schermi siRNA quindi studiare vie cellulari coinvolti nella infezione di cellule ospiti di L. monocytogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi parametri sono fondamentali per il successo del nostro protocollo InlC rilevamento, compreso l'uso di linee di cellule sane visualizzazione sufficientemente grande citoplasma per consentire una rilevazione univoca del segnale InlC. Nel saggio che presentiamo in questo articolo vi proponiamo l'uso di cellule HeLa CCL2, che sono particolarmente adatti per la nostra analisi a causa della estensione del loro spazio citosolico; altri cloni HeLa come le cellule HeLa Kyoto mostrano un citoplasma più piccolo, m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca in laboratorio P. Cossart è supportata dall'Istituto Pasteur, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l'Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), l'Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fondazione Louis-Jeantet e la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK è un destinatario di una borsa di studio dal Pasteur-Parigi Università internazionali Dottorato / Institut Carnot Maladies infectieuses. Ringraziamo Jason Mercer per ottimizzare il protocollo di trasfezione cellulare.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
Riferimenti
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