הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים
Summary
השתלת מערכים מאורגנים של microwires לשימוש בקלטות אלקטרו יחידה אחת מציגה מספר האתגרים טכניים. שיטות לביצוע טכניקה זו ואת הציוד הדרוש מתוארות. כמו כן, השימוש מועיל של מערכי Microwire מאורגנים להקליט מאזורי משנה עצביים שונים עם סלקטיביות מרחבית גבוהה נדון.
Abstract
בקלטות אלקטרו vivo בערים, חיה מתנהגת לספק שיטה רבת עוצמה להבנת איתות עצבית ברמת התא הבודד. הטכניקה מאפשרת הנסיינים לבחון temporally ואזורי דפוסי ירי ספציפיים על מנת לתאם פוטנציאל פעולה מוקלט עם התנהגות מתמשכת. יתר על כן, ניתן לשלב הקלטות יחידה אחת עם שפע של טכניקות אחרות על מנת לייצר הסברים מקיפים של תפקוד עצבי. במאמר זה, אנו מתארים את ההרדמה והכנה להשתלת Microwire. בהמשך לכך, אנו למנות את הציוד הנדרש וצעדים כירורגיים להוספת מערך Microwire למבנה יעד מדויק. לבסוף, נתאר בקצרה את הציוד המשמש להקלטה מכל אלקטרודה בודדת במערך. מערכי Microwire הקבועים שתוארו מתאימים היטב להשתלה כרונית ולאפשר להקלטות אורך של נתונים עצביים בכמעט כל preparati התנהגותייםהלאה. אנחנו דנים בהתחקות מסלולי אלקטרודה לtriangulate עמדות Microwire כמו גם דרכים לשלב השתלת Microwire עם טכניקות immunohistochemical על מנת להגדיל את הספציפיות האנטומי של תוצאות שנרשמו.
Introduction
קלטות אלקטרו לאפשר למדענים לבחון את התכונות חשמליות של תאים ביולוגיים. במערכת העצבים המרכזית, שבו דחפים חשמליים לשמש כמנגנון איתות, ההקלטות הללו הן בעלי חשיבות מיוחדת להבנת תפקוד עצבי 1-2. במהלך הקלטות יחידה אחת במתנהג בעלי חיים, microelectrode שהוכנסה לתוך המוח היא מסוגלת להקליט את השינויים בדור של נוירון של פוטנציאל פעולה לאורך זמן.
בעוד טכניקות רבות מאפשרות אחד כדי להקליט את פעילות המוח, אלקטרופיזיולוגיה יחידה אחת היא אחת השיטות מדויקות ביותר על ידי המאפשר רזולוציה ברמת תא העצב היחיד. כאשר רמה גבוהה של ייחוד המרחבי היא רצויה, ניתן להשתמש microwires למקד תת גרעינים או הרכבים של תאים בתוך brain3 בדידים. הקלטות יחידה אחת גם ליהנות מרזולוציה גבוהה זמנית כמו הקלטות מדויקות ברמת המיקרו. ו, in vivoהקלטות בעקבות לאפשר אינטראקציות מעגל שלמות, עם הסביבה הטבעית של תחזיות מביא וefferent, כימי מערכתיות והשפעות הורמונליות, ופרמטרים פיסיולוגיים. אותות עצביים נגזרים מקלט חושי, התנהגויות מוטוריות, עיבוד הקוגניטיבי, כימיה של המוח / פרמקולוגיה, או שילוב כלשהו. בהתאם לכך, ההפרדה של השפעות חושיות, מוטורית, קוגניטיביים, וכימיות מחייבת ניסויים היטב הגה עם מקרים יעילים ובקרות שעשויות לאפשר הערכה של כל אחת מההשפעות האמורות. בסך הכל, הקלטות במתנהגים בעלי חיים מאפשרים הנסיינים להתבונן האינטגרציה של מספר רב של מקורות מידע בתוך מעגל תפקוד ולגזור מודל מקיף יותר של תפקוד במעגל.
הקלטות יחידה אחת סובלות גם ממספר החסרונות שלה כל ניסוי צריך להיות מודע. בראש ובראשונה, הקלטות יכולות להיות קשות לנהל. ואכן, מאפיינים של המגברי headstage דואר וmicrowires המושתלים המאפשרים לסגולית מרחב ובזמן בהקלטות אלה גם עושה הקלטות רגישות להשפעתם של אותות חשמליים חיצוניים (כלומר "רעש" חשמלי). בהתאם לכך, היכולת לפתור בעיות במערכת אלקטרו מחייבת הבנה טכנית מפותחת של עקרונות ומכשירי אלקטרו. כמו כן, חשוב לציין כי, בנסיבות מסוימות, אותות חשמליים שנרשמו בהקלטות תאית יכולים לייצג את הסיכום של אותות עצביים מרובים. יתר על כן, ההכללה של פעילות יחידה אחת לפעילות אוכלוסייה בתוך אזור יעד יכולה לעתים קרובות להיות מוגבלת על ידי מידת ההטרוגניות סלולרית בתוך אזור היעד (אך ראה 4 קרדן). לדוגמא, אלקטרודות עשויות להיות מוטות לכיוון הקלטת נוירונים פלט משרעת גבוהה במקום תאים אחרים. Interpretability של הקלטות יחידה אחת הוא גדלעל ידי שילוב הקלטות עם טכניקות אחרות, כולל, אך לא מוגבל ל, חשמל (orthodromic או antidromic), כימי גירוי (למשל iontophoretic או קולט מעצב) או optogenetic 4, inactivations העצבי זמני, בדיקות הסנסורית 5, נהלי ניתוק, או אימונוהיסטוכימיה 3.
בפרוטוקול שלהלן אנו למנות את החומרים וצעדים הדרושים כדי להשתיל מערך Microwire מאורגן בחולדה (למרות שהפרוטוקול יכול להיות מותאמים לשימוש במינים אחרים). ההליך והסגנון של מערכים קבועים המשמשים במעבדה שלנו הוכיחו אמינים להקלטות אורכי ויכולים לקיים את הקלטות מאותו תא העצב ללאורך הזמן של חודש אחד 6-8. זה עושה את זה הליך אידיאלי לבחינת תגובות phasic לגירויים ניסיוניים, שינויים פלסטיים בתגובות עצביות, או מנגנונים של למידה ומוטיבציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקלטות תאיים מייצגות טכניקה ניסויית רבת עוצמה שניתן לשלב כמעט כל הכנה ניסיונית במדעי המוח. חוטים שכבר מושתלים במערכים מאורגנים יכולים להיות במעקב כפירים שלהם עוברים דרך המוח ולאזור היעד שלהם (איור 5 א). כאשר נגע קטן, שלאחר ניסוי נוצר בקצה Microwire noninsulated ליצור ה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים מעניק DA 006,886 (MOW) והתובע 032,270 (DJB).
Materials
| Table 1. List of Surgical Materials | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotton Swabs | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methyl Nitrate | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketamine Hydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidone-Iodine) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Cauterizing Tool | Stoelting | 59017 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ445 | |
| Dental Drill | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatic Saline | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Skrews | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Ground Wire | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbable Sutures | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) | Fisher (Henry Schein) | 008897 |
| Table 2. List of Surgical Instruments | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann & Co. | #160-57 | Multi-use (e.g. clearing debris in skull window) |
| 2x Forceps | George Tiemann & Co. | #160-93 | Multi-use (e.g. tying sutures) |
| 6x Hemostats | George Tiemann & Co. | #105-1125 | Clamp and open incision |
| 1x Small scissors | George Tiemann & Co. | #105-411 | Cut sutures after tying |
| 1x Tissue forceps | George Tiemann & Co. | #105-222 | Holding tissue while suturing |
| 1x Needle holder | George Tiemann & Co. | #105-1259 | Holding suture needle |
| 1x Scalpel holder (with #11 blade) | George Tiemann & Co. | #105-80 (w/ #105-71 blade) | Making skull incision |
| 1x # 22 Scalpel blade | George Tiemann & Co. | # 160-381 | Shaving scalp |
| 1x Surgical Spatula | George Tiemann & Co. | #160-718 | Scraping skull to clear tissue on skull |
| Machine/Jewelers Screws | Various | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A | Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc. |
| (Part No. Based on array characteristics) | |||
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals. |
| Commutator (& Optional Fluid Swivel) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp |
| Pre-Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Differentially amplifies neural signals against a reference electrode. |
| Filter & Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition. |
| A/D Card | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitizes neural signals for computer sampling. |
| Digital I/O Card | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Acquires behavioral inputs and outputs |
Riferimenti
- Carter, M., Shieh, J. C. . Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R., Kupfer, D., Bloom, F. E. . Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. , (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
- Ma, S., et al. Amphetamine’s dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
- Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
- Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
- . National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
- Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
- Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 .
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
