שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
הפונקציה של exosomes במחזור המדויקת נשארה לא ידועה לתקופה ארוכה של זמן. אפילו עכשיו מנגנון נתיב המלא של exosomes לא מובן לחלוטין. מאז exosomes לשאת אנטיגנים, חלבונים ו- RNA (mRNA ומירנה) המתייחס לתא שלהם ההורים ממוצא, תפקידם כמשדרי איתות תאי תאים יש בעיקר ניתנו עדיפות.
שיטות שונות רבות תוארו בספרות לבידוד וזיהוי כמותי של exosomes 1,2. עם זאת, לא הושגה הסכמה על "תקן זהב". בינתיים רוב המדענים הפועלים בתחום מחקר exosome מסכימים ששיטה של בידוד עקבי היא מוצדקת מאוד כדי להשיג רמה גבוהה יותר של השוואתיים בין דוחות ומחקרים שונים.
מיון הקרינה מופעל תאים (FACS) הוא הכלי הנפוץ והשכיח ביותר לניתוח exosome 3. FACS יש בןefit ש, באמצעות תיוג הקרינה, ניתן להשוות תאים ממקורות שונים בצעד אחד. החסרונות העיקריים של FACS הם ששיטה זו אינה רגישה מספיק כדי לזהות חלקיקים קטנים מ -0.5 מיקרומטר 4, ואילו exosomes הן בדרך כלל בין 30-120 ננומטר בקוטר 5, אפילו פחות כדי למדוד את הגודל שלהם.
במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) הם כלים אחרים לניתוח גודל חלקיקים ומורפולוגיה של exosomes. עם זאת, שני SEM וTEM החסרון כי הכנת הדגימות היא, בשתי השיטות כרוכות בצעדים עתיר עבודת זמן רב וכל אחד יש סיכון מסוים של דור חפץ. לא השיטה מתאימה לתפוקת מדגם גבוהה ואפיון של כמה אלפי חלקיקים בודדים של מדגם אחד. יתר על כן, ניתוח כמותי לשגרה יומית קלינית שבו דגימות יש לעתים קרובות כדי להיות מנותח בו זמנית, או לפחות בפרק זמן קצר מאוד הואקשה לביצוע. טכניקות דור חדשות עכשיו מאפשרות לנו לנתח exosomes ללא עבודה אינטנסיבית לפני ההכנה (SEM למשל, איכות הסביבה). הטכניקות המודרניות אלה הן עדיין לא נוחים לניתוח השעיות נפח גדולים המכילות exosomes לקבוע מספר הממוצע שלהם והתפלגות גודל 6.
שיטה נוספת רגישה מאוד להדמיה וניתוח של exosomes היא ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (נת"ע). שיטה זו מנצלת את שני עקרונות שונים של פיסיקה. ראשית, חלקיקים מזוהים על ידי האור מפוזר כאשר הם מוקרנים עם קרן לייזר. התופעה השנייה ידועה בשם התנועה בראונית, לפיה דיפוזיה של חלקיקים שונים בהשעית נוזל עומד ביחס הפוך לגודלם. במקרה האחרון התנועה תלויה גם בטמפרטורה והצמיגות של הנוזלים. עם זאת, שיעור זה קשור באופן ישיר לגודל חלקיקים ומשמש את נת"ע. באמצעות רךניתוח מבוסס-ware, תמונות דיגיטליות של אור מפוזר מחלקיקים בודדים נרשמות. חלקות של כתמים מפוזרים אור ומהירות תנועה שלהם לספק נתונים המאפשרים קביעת ספירת חלקיקים כוללת והפצת גודל. טכניקה זו היא חזקה במיוחד לניתוח חלקיקים בקוטר ממוצע של פחות מ -100 ננומטר.
מדידות הגודל וריכוז מבוצעות עם ראונית ZetaView ואלקטרופורזה Motion Video ניתוח מיקרוסקופים. זהו מכשיר אוטומטי למחצה שולחן ננו-חלקיקים העליונים ניתוח לדגימות נוזליים (להלן ככלי מעקב אחר החלקיקים). זה מורכב של מנתח מעקב החלקיקים, כמו גם מחשב נייד עם התוכנה המשמשת לניתוח נתונים. דגימות ביולוגיות הטרוגנית הן כמתאימות לשיטה זו כמתלים הומוגנית יותר של חלקיקים אורגניים. מיקרוסקופ פיזור לייזר עם מצלמת וידאו משמש לזיהוי של חלקיקים ולobservation של תנועתם. בעוד ציר מיקרוסקופ הוא אופקי וממוקד לערוץ התא המלא בהשעיה מכילה exosomes, קרן הלייזר בכיוון אנכית. החלקיקים מוקרנים על ידי פיזור לייזר האור, אשר נרשם תחת 90 מעלות במצלמת וידאו דיגיטלית באמצעות מיקרוסקופ (איור 1). עוצמת האור המפוזר מאפשרת תצפית של חלקיקים גדולים יותר בקוטר 60 ננומטר. בסביבה כזו הבהירות של חלקיק היא לא האינדיקציה היחידה של גודל חלקיקים. כאשר אין שדה חשמלי מוחל, תנועת חלקיקים כדלקמן רק תנועה בראונית ועשויה לשמש כמדד לחישוב גודל חלקיקים. עם זאת, המכשיר הוא גם מסוגל החלת שדה חשמלי על פני ערוץ התא. כאשר נתון תחום זה, את הפוטנציאל, הקוטביות ורמת יונית-אחראי exosomes המושעה להיות גורמים נוספים לכיוון התנועה שלהם. מהירות וכיוון בתוצאת מו electrophoreticהיסטוגרמה bility.
תוך מציאת שיטה אופטימלית לניתוח exosomes המבודד בעיה אחת, עוד אחד נמצא בבידוד היעיל של exosomes מהתחומים שונים, כגון דם, מיימת, שתן, חלב, מי שפיר או תקשורת סלולארי. שיטות שונות תוארו עד כה, אשר מבוססות על ultracentrifugation 1, ריאגנטים תעשייתיים הפרדה (כגון Exoquick) 7, חרוזים מגנטיים לאנטיגן העסקת הפרדה 8 או 9 אולטרה שלבים.
בפרוטוקול זה אנו מראים את כל התהליך של בידוד exosome באמצעות ultracentrifugation ולהראות כיצד לנתח את exosome כתוצאה מכיל השעיה באמצעות מכשיר מעקב אחר חלקיקים. שיקולים ספציפיים לניתוח exosomes נגזר בינוני פלזמה או תרבית תאים האנושיות מסופקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו מדגימים פרוטוקול מפורט לבידוד exosome מהדם ומעקב ננו-חלקיקים נוכחי כחדשני ושיטה חדשנית למדידת גודל exosome וריכוז בנוזל ביולוגי. בניסויים שהוצגו דם היקפי אדם שימש כמקור exosomes. עם זאת, מקורות אחרים, כגון שתן, כיח, supernatant תרבית תאים, וכו ', יכולים לשמש גם כחומר למבחן.
בהתבסס על השונות הביולוגיות של ריכוז exosome בבני אדם, מבחני מאנשים שונים עשויים כוללים ריכוז להפליא משתנה של exosomes. עם זאת, הריכוז של חלקיקים בבדיקת המבחן הביולוגית עלול להיות השפעה על התוצאות. לכן, יש צורך בגישה אמינה וסטנדרטית לדילול של בדיקות. בשיטה המוצגת הפלזמה exosome מכיל נוצרה מ9 מיליליטר של כל דם היקפי. באמצעות צנטריפוגה ההפרש צעדים גלולה exosome הייתה מבודדת מ פלזמה ו 1 מיליליטר מחדש תלויה 5 מיליליטר מים מזוקקים לתוצאה במדגם העבודה של exosomes המושעה. הגדרה מוגדרת מראש זה סיפקה לנו ריכוז נכון של חלקיקים, כלומר, עוצמת פיזור מתאימה במהלך נת"ע. לצד היבט הנפח ודילול, ההרכב של הפתרונות המשמשים גם הוא בעל חשיבות. יש לנו להשתמש במים מזוקקים במשך מחדש ההשעיה הסופית של exosomes. כמובן, עשויה לשמש גם אמצעי תקשורת שונה לצעד הדילול הסופי, בהתאם לדרישות של ניסיוני ההגדרה. עם זאת, במקרה של מדידות zeta פוטנציאל של פתרונות-יוניים, במיוחד כאשר בודקים דגימות עם קיבולת חציצה, דילול זהיר בתנאים חופשיים מערבולת שימושי. לשם ההשוואה הישירה של דגימות מרובות אנו ממליצים לשמור על אותה רמת דילול עבור כל הדגימות. כל ההגדרות, מלבד הרגישות ורזולוצית וידאו ניתן לשנות לאחר מכן על ידי שימוש בתוכנת ZetaView ניתוח.
<p class="Jove_content"> למרות שהחוקרים מאמינים כי המערכת הציגה במסמך זה כרגע מייצגת את המכשיר המתאים ביותר, זה לא מערכת נת"ע זמינה רק. מספר הדיווחים הקודמים מועסק מערכות אחרות שחלות אותם עקרונות נת"ע אבל מספקים עיצוב מכשיר אחר שהולך יחד עם כמה תכונות שונות 10. אנו מאמינים כי היבטים מעשיים הנוגעים לטיפול במדגם ושחזור של התוצאות הם בעלי חשיבות מרכזית בבחירת הרצף מתודולוגיים להערכת exosome. כמו כן, אנו מאמינים כי מערכת איתור אידיאלית צריכה לחסל גורמים-תלוי משתמש שעלול להפריע לתוצאות של המדידות. גישת ניתוח exosome שמוצג כאן מקיימת את המבחן של טיפול קל לרמה גבוהה. כיתרון נוסף, הניתוח אוטומטי למחצה של הדגימות מתבצע בתהליך מהיר, שהניבו תוצאות בזמן קצר. הדמיה מקוונת של exosomes מסייעת המנתח לgaברעיון מיידי של מאפייני exosome, למשל, ריכוז ברוטו.בנוסף מאוד פשוט אך אלגנטי לטכניקת המדידה שהוצגה כאן הוא השימוש בנוגדן שכותרתו exosomes והלכידה של קרן הלייזר מפוזרת באמצעות מסנן הקודם מול הגלאי. בדרך זו תת-אוכלוסיות exosome ניתן להבחין על פי אנטיגנים פני השטח ומאפיינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית אחרים, כי הם מבחינה טכנית נגישות לצביעת ניאון סלקטיבית.
אחד חסרונות של הגרסה הנוכחית של מכשיר מעקב חלקיקים שלנו הוא העובדה כי ברמות רגישות גבוהות מאוד חפצים כגון רעשי רקע יכולים להיות נוכחים, המבוסס על קיר ערוץ תא. פתרון טכני ושיפור למערכת הנוכחית עשויים להיות זמינים בעתיד הקרוב. על ידי השתקפויות שיטה זו של אור לייזר הפיזור על קיר הערוץ יקטן, ובכך להגדיל הדיוק של האותות הנמדדים ונתונים המתקבלים והוריד את המגבלה של זיהוי.
אף על פי הפרוטוקול המשמש כיום לבידוד exosome מבוסס היטב ויש לו מכשיר מעקב חלקיקים מיושם רזולוציה מדויקת להפליא עם התפלגות גודל נמוכה יותר של 30 ננומטר, אין ערובה לכך שהחלקיקים זוהו אכן exosomes לגמרי נכון. חלקיקים אחרים, כגון שברי תאים מתים או קומפלקסי חלבונים גדולים יותר עשויים גם להיות נוכחים בהשעית exosome ולהוביל לאותות חיוביים כוזבים. שיטה אמינה אחד שבו "זיהום" כזה יכול להיות שלילי עשוי להיות במיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או EM שידור או EM סריקה. למרבה הצער, אין סמן כללי וספציפי לexosomes זוהה עד כה, אם כי מספר סמני משטח הציעו בעבר זכה כמות הולך וגדלה של תשומת לב, כוללים tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, וכו '11.
"> ללא קשר להתקדמות בעתיד של מחקר על הביולוגיה exosome, בעיקר בכל הנוגע סמנים ספציפיים exosome, הפרוטוקול המוצג כאן יספק שיטה רבת עוצמה לבידוד וזיהוי של exosomes. ריכוז וגודל יכולים להיקבע בקלות בסיוע תוכנה אופנה פשוטה. התוספת של סמני ניאון סלקטיבית או נוגדני fluorophore בשילוב צפוי לשפר עוד יותר את היישומים האפשריים של הגישה שהוצגה של נת"ע.Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Riferimenti
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
