Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
Die genaue Funktion des zirkulierenden Exosomen blieb lange Zeit unbekannt. Selbst jetzt der vollständige Pfad Mechanismus Exosomen ist nicht vollständig geklärt. Seit Exosomen tragen Antigene, Proteine und RNA (mRNA und miRNA), die sie bezieht sich auf ihre elterlichen Ursprungszelle, ihre Funktion als Zell-Zell-Signalgeber wurde vor allem im Vordergrund.
Viele unterschiedliche Verfahren werden in der Literatur für die Isolierung und quantitativen Nachweis von Exosomen 1,2 beschrieben. Jedoch keinen Konsens über eine "Goldstandard" erreicht wurde. Inzwischen ist die Mehrheit der Wissenschaftler auf dem Gebiet der Forschung tätig Exosom einig, dass eine konsistente Methode der Isolation ist sehr gerechtfertigt, um ein höheres Maß an Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Berichten und Studien zu erzielen.
Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist die häufigste und verbreitet Werkzeug zur Analyse exosome 3. FACS hat die beneFit, die über Fluoreszenzmarkierung, Zellen verschiedener Herkunft kann in einem Schritt verglichen werden. Die Hauptnachteile FACS sind, dass dieses Verfahren nicht empfindlich genug ist, um Teilchen, die kleiner als 0,5 um 4 zu identifizieren, während Exosomen sind im Allgemeinen zwischen 30-120 nm Durchmesser 5, sogar noch weniger, um ihre Größe zu messen.
Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sind andere Werkzeuge für die Analyse der Partikelgröße und die Morphologie der Exosomen. Sowohl SEM und TEM haben jedoch den Nachteil, dass die Probenvorbereitung ist zeitaufwendig, wobei beide Verfahren beinhalten arbeitsintensive Schritte, und jeder hat ein gewisses Risiko einer Artefakterzeugung. Beide Verfahren sind für einen hohen Probendurchsatz und Charakterisierung von mehreren tausend Einzelpartikeln einer Probe. Darüber hinaus, um eine quantitative Analyse der klinischen Alltag, wo Proben oft gleichzeitig oder zumindest in einem sehr kurzen Zeitraum analysiert werdenschwierig durchzuführen. Techniken der neuen Generation jetzt können wir Exosomen ohne vorherige intensive Vorbereitungsarbeiten (zB Umwelt SEM) analysiert. Die modernen Techniken sind immer noch für die Analyse von großen Volumen Suspensionen, die Exosomen, ihre durchschnittliche Anzahl und Größenverteilung 6 bestimmen eher unbequem.
Ein weiteres hochempfindliche Methode zur Visualisierung und Analyse von Exosomen ist Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Dieses Verfahren nutzt den Vorteil von zwei unterschiedlichen physikalischen Prinzipien. Zunächst werden Teilchen, die durch das Licht gestreut, wenn sie mit einem Laserstrahl bestrahlt werden erkannt. Das zweite Phänomen ist als Brownsche Bewegung bekannt, wonach die Diffusion verschiedener Partikel in einer flüssigen Suspension ist umgekehrt proportional zu ihrer Größe. Im letzteren Fall hängt die Bewegung auch von der Temperatur und der Viskosität der Flüssigkeit. Dennoch ist diese Rate direkt an Partikelgröße bezogen und wird von NTA verwendet. Über Software-basierte Analyse, digitale Bilder von Streulicht aus einzelnen Teilchen werden aufgezeichnet. Grundstreulichtflecken und ihre Bewegungsgeschwindigkeit liefern die Daten, die die Bestimmung der Gesamtpartikelanzahl und Größenverteilung zu erleichtern. Diese Technik ist besonders leistungsfähig für die Analyse von Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm.
Die Größe und Konzentrationsmessungen mit dem Zetaview Brownsche Bewegung und Elektrophorese Videoanalyse-Mikroskop durchgeführt. Dies ist ein halbautomatisches Tischnanopartikelanalysegerät für flüssige Proben (im folgenden als der Partikelverfolgungsinstrument bezeichnet). Es besteht aus der Partikelbewegung Analysator sowie einen Laptop mit der für die Datenanalyse verwendet Software. Heterogenen biologischen Proben sind für dieses Verfahren geeignet als homogener Suspensionen von anorganischen Partikeln. Ein Laserstreuung-Mikroskop mit einer Videokamera zur Erfassung von Teilchen und für die Obse verwendetrvation ihrer Bewegung. Während die Mikroskopachse horizontal ist und in den Zellkanal mit einer Suspension, die Exosomen gefüllt fokussiert, wird der Laserstrahl vertikal ausgerichtet. Die Teilchen, die durch die Laserlichtstreuung, die unter 90 ° von einer digitalen Videokamera über die Mikroskop (siehe Abbildung 1) bestrahlt wird. Die Intensität des gestreuten Lichts ermöglicht die Beobachtung der Teilchen größer 60 nm Durchmesser. In einer solchen Einstellung wird die Helligkeit eines Teilchens ist nicht die einzige Indikation der Partikelgröße. Wenn kein elektrisches Feld angelegt wird, nur Teilchenbewegung folgt Brownsche Bewegung und kann als Indikator für die Berechnung der Teilchengröße dienen. Jedoch ist das Gerät auch in der Lage, das Anlegen eines elektrischen Feldes über dem Zellenkanal. Wenn zu diesem Feld ausgesetzt wird, das Potential, Polarität und das Niveau der Ionenladung der suspendierten Exosomen werden weitere Determinanten für die Richtung der Bewegung an. Geschwindigkeit und Richtung ergeben eine elektrophoretische mokeit Histogramm.
Während der Suche nach einer optimalen Methode isoliert Exosomen analysieren ist ein Problem, liegt ein weiterer in der wirksamen Isolierung von Exosomen aus unterschiedlichen Medien, wie etwa Blut, Aszites, Urin, Milch, Fruchtwasser oder Zellmedien. Verschiedene Methoden wurden bisher die basieren beschrieben, auf Ultrazentrifuge 1, industrielle Trennung Reagenzien (wie Exoquick) 7, magnetische Kügelchen für Antigen Einsatz Trennung 8 oder Ultrafiltration Schritte 9.
In diesem Protokoll zeigen wir den gesamten Prozess der Exosom Trennung über Ultrazentrifugation und zeigen, wie man die resultierende Exosom enthaltende Suspension über die Partikelverfolgung Instrument analysieren. Besondere Erwägungen für die Analyse von menschlichem Plasma oder Zellkulturmedium abgeleitete Exosomen bereitgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir zeigen ein detailliertes Protokoll für Exosom isoliert von Blut und Gegenwart Nanopartikel Tracking als neuartige und innovative Methode, um Exosom Größe und Konzentration in einer biologischen Flüssigkeit zu messen. In den vorgestellten Experimenten wurde menschlichem peripheren Blut als Ursprung der Exosomen verwendet. Jedoch können auch andere Ursachen, wie etwa Urin, Sputum, Zellkulturüberstand etc., die auch als Testmaterial verwendet werden.
Basierend auf der biologischen Variabilität exosome Konzentration beim Menschen kann von Tests verschiedener Individuen einen bemerkenswert unterschiedlichen Konzentration von Exosomen verfügen. Jedoch kann die Konzentration der Teilchen in dem biologischen Testsonde eine Auswirkung auf die Ergebnisse. Daher wird eine zuverlässige und Standardansatz für die Verdünnung der Proben notwendig. In der vorgestellten Methode wurde Exosom haltigen Plasma von 9 ml peripheres Vollblut erzeugt. Mit Differentialzentrifugation Schritte ein Exosom Pellet aus isoliert1 ml Plasma und in 5 ml destilliertem Wasser, um in der Arbeitsprobe ausgesetzt Exosomen führen resuspendiert. Diese vordefinierten Einstellung hat uns mit einer geeigneten Konzentration von Partikeln, dh entsprechende Streuintensität während NTA zur Verfügung gestellt. Neben dem Volumen und Verdünnen Aspekt ist die Zusammensetzung der Lösungen, die verwendet werden, von Bedeutung. Wir haben destilliertem Wasser für den letzten Resuspension von Exosomen verwendet. Natürlich können verschiedene Medien für die endgültige Verdünnung verwendet werden, je nach den Anforderungen des experimentellen Aufbaus. Im Fall des Zetapotentialmessungen von ionischen Lösungen, insbesondere für die Prüfung Proben mit Pufferkapazität ist jedoch eine vorsichtige Verdünnung in Turbulenz freien Bedingungen nützlich. Für den direkten Vergleich mehrerer Proben empfehlen wir halten die gleiche Verdünnungsstufe für alle Proben. Alle Einstellungen außer der Empfindlichkeit und der Bildauflösung kann anschließend mit der Zetaview Analysis Software geändert werden.
<p class="Jove_content"> Obwohl die Autoren glauben, dass die hier vorgestellte System stellt derzeit das am besten geeignete Instrument, es ist nicht die einzige verfügbare NTA-System. Eine Reihe von früheren Berichten haben andere Systeme, die die gleichen Grundsätze gelten NTA, bieten aber ein anderes Instrument Design, das zusammen mit einigen unterschiedlichen Funktionen 10 geht beschäftigt. Wir glauben, dass die praktischen Aspekte bezüglich der Handhabung der Proben und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sind von zentraler Bedeutung bei der Auswahl der Methodensequenz für Exosom Auswertung. Wir glauben auch, dass eine ideale Erkennungssystem sollte benutzerabhängige Faktoren, die die Ergebnisse der Messungen stören, zu beseitigen. Die Exosom Analyse Ansatz, der hier präsentiert wird erfüllt das Kriterium der einfachen Handhabung zu einem hohen Grad. Als weiterer Vorteil ist die halbautomatische Analyse der Proben in einem schnellen Prozess durchgeführt wird, Erzeugen Ergebnisse in kurzer Zeit. Eine Online-Visualisierung von Exosomen hilft dem Analysator gain einem Augenblick Idee der Exosom Eigenschaften, zB Brutto-Konzentration.Eine sehr einfache, aber eleganten Neben der Meßtechnik präsentierten die Verwendung von Antikörper markiert Exosomen und die Erfassung der gestreuten Laserstrahl durch Verwendung eines vorhergehenden Filter vor dem Detektor. Auf diese Weise kann Exosom Subpopulationen entsprechend ihrer Oberflächenantigenen und anderen biologisch relevanten Eigenschaften, die technisch zugänglich selektiver Fluoreszenzfärbung sind zu unterscheiden.
Ein Nachteil der gegenwärtigen Version unserer Particle Tracking Instrument ist die Tatsache, dass bei sehr hohen Empfindlichkeitsniveaus Artefakte wie Hintergrundrauschen vorhanden sein, die auf der Zellkanalwand basiert. Eine technische Lösung und Verbesserung des derzeitigen Systems verfügbar sein werden in der nahen Zukunft. Durch diese Methode Reflexionen des Laserlichtstreuung an der Kanalwand reduziert werden, wodurch die die Genauigkeit der gemessenen Signale und erhaltenen Daten und Absenken der Nachweisgrenze.
Obwohl die derzeit verwendete Protokoll für Exosom Isolierung ist gut etabliert und die aufgebrachte Partikelverfolgung Instrument hat eine bemerkenswert genaue Auflösung mit einer geringeren Größenverteilung von 30 nm, gibt es keine Garantie, dass die detektierten Partikel sind in der Tat ganz richtig Exosomen. Andere Teilchen, wie tot Zellfragmente oder größere Proteinkomplexe können auch im Exosom Suspension vorliegen und führen zu falsch positiven Signalen. Ein zuverlässiges Verfahren, mit denen solche "Verschmutzung" ausgeschlossen kann Elektronenmikroskopie (EM), entweder Übertragungs EM oder Scannen EM sein. Leider hat sich kein allgemeiner und spezifischer Marker für Exosomen wurden bisher identifiziert, obwohl eine Reihe von bisher vorgeschlagenen Oberflächenmarker haben eine zunehmende Menge an Aufmerksamkeit, einschließlich Tetraspanin (tspan), CD81, C63, CD9 usw. 11 gewonnen.
"> Unabhängig von der künftigen Fortschritte der Forschung auf Exosom Biologie, insbesondere in Bezug auf Exosom spezifische Marker, das Protokoll, das hier vorgestellt wird, wird ein leistungsfähiges Verfahren zur Isolierung und zum Nachweis von Exosomen Verfügung zu stellen. Die Konzentration und Größe können leicht in einem softwaregestützten bestimmt werden einfache Art und Weise. Der Zusatz von selektiven Fluoreszenzmarkern oder Fluorophor gekoppelt Antikörper wird wahrscheinlich weiter erhöhen die Einsatzmöglichkeiten der vorgestellten Ansatz der NTA.Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Riferimenti
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
