Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
De exacte functie van circulerende exosomes bleef onbekend lange tijd. Zelfs nu het volledige pad mechanisme exosomes is niet volledig begrepen. Sinds exosomen dragen antigenen, eiwitten en RNA (mRNA en miRNA) die hen betrekking heeft op hun ouderlijke cel van herkomst, hun functie als cel-cel signalering zenders heeft vooral prioriteit gegeven.
Vele verschillende werkwijzen in de literatuur beschreven voor de isolatie en kwantitatieve detectie van exosomes 1,2. Er is echter geen consensus over een 'gouden standaard' is bereikt. Inmiddels is de meerderheid van de wetenschappers die actief zijn op het gebied van exosome onderzoek het erover eens dat een consistente methode van isolatie zeer gerechtvaardigd is om een hogere mate van vergelijkbaarheid van de verschillende rapporten en studies te bereiken.
Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) is de meest voorkomende en voorkomende instrument exosome analyse 3. FACS heeft de BenEFIT dat via fluorescentie labeling cellen van verschillende oorsprong kunnen worden vergeleken in een stap. De belangrijkste nadelen van FACS zijn dat deze methode niet gevoelig genoeg om deeltjes kleiner dan 0,5 pm 4 identificeren, terwijl exosomes algemeen tussen 30-120 nm in diameter 5, nog minder om hun grootte te meten.
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) zijn andere instrumenten voor het analyseren van deeltjesgrootte en morfologie van exosomes. Zowel SEM en TEM hebben het nadeel dat monstervoorbereiding is tijdrovend, beide werkwijzen omvatten arbeidsintensieve stappen en elk enig risico artefact generatie. Noch methode is geschikt voor hoge sample throughput en karakterisering van verschillende duizenden enkele deeltjes van één monster. Bovendien is een kwantitatieve analyse van klinische dagelijkse routine waar monsters vaak gelijktijdig of tenminste geanalyseerd in een zeer korte periodemoeilijk uit te voeren. Nieuwe generatie technieken maken ons nu op exosomen analyseren zonder voorafgaande intensieve voorbereidende werkzaamheden (bijvoorbeeld milieu SEM). Deze moderne technieken zijn nog steeds vrij lastig voor het analyseren van grote hoeveelheden suspensies die exosomen om hun gemiddelde aantal en de grootte distributie 6 te bepalen.
Een andere zeer gevoelige werkwijze voor visualisatie en analyse van exosomes is nanodeeltjes bijhouden analyse (NTA). Deze methode maakt gebruik van twee verschillende principes van de fysica. Eerst worden deeltjes gedetecteerd door het verstrooide licht wanneer ze worden bestraald met een laserbundel. Het tweede fenomeen is bekend als Brownse beweging, volgens welke de diffusie van verschillende deeltjes in een vloeibare suspensie is omgekeerd evenredig met hun omvang. In het laatste geval de beweging ook afhankelijk van de temperatuur en de viscositeit van de vloeistof. Toch wordt dit percentage direct gerelateerd aan de deeltjesgrootte en wordt gebruikt NTA. Met behulp van zachteware-gebaseerde analyse, digitale beelden van verstrooid licht van enkele deeltjes worden opgenomen. Percelen van verstrooid licht vlekken en hun snelheid van de beweging te verstrekken van de gegevens die de bepaling van de totale telling deeltje en grootteverdeling vergemakkelijken. Deze techniek is bijzonder krachtig voor het analyseren van deeltjes met een gemiddelde diameter van minder dan 100 nm.
De omvang en concentratie metingen worden uitgevoerd met de ZetaView Brownse en Elektroforese Motion Video Analysis Microscoop. Dit is een halfautomatisch desk top nanodeeltjes analyseapparaat voor vloeistofmonsters (hierna het deeltje volgen instrument). Het bestaat uit het deeltje volgen analysator en een laptop met de software die voor de gegevensanalyse. Heterogene biologische monsters zijn geschikt voor deze werkwijze meer homogene suspensies van anorganische deeltjes. Een laser verstrooiing microscoop met een videocamera wordt gebruikt voor de detectie van partikels en de observation van hun beweging. Terwijl de microscoop as horizontaal en zich in de cel kanaal gevuld met een suspensie die exosomes, wordt de laserbundel verticaal georiënteerd. De deeltjes bestraald door de laser verstrooien het licht, dat is opgenomen onder 90 ° met een digitale camera via de microscoop (Figuur 1). De intensiteit van het verstrooide licht maakt waarneming van deeltjes groter 60 nm diameter. In een dergelijke omgeving de helderheid van een deeltje is niet het enige indicatie van deeltjesgrootte. Als er geen elektrisch veld wordt toegepast, deeltjesbeweging volgt alleen Brownse beweging en kan als een indicator voor het berekenen deeltjesgrootte dienen. Echter, het instrument kan ook het aanbrengen van een elektrisch veld over de cel kanaal. Bij blootstelling aan dit gebied, de mogelijke, polariteit en het niveau van de ionische lading van de zwevende exosomes worden verder determinanten van de richting van hun beweging. Snelheid en richting resulteren in een elektroforetische mobaarheid histogram.
Terwijl vinden van een optimale methode geïsoleerde exosomes analyseren is één probleem, een ander ligt in de effectieve isolatie van exosomen uit verschillende media, zoals bloed, ascites, urine, melk, vruchtwater of celmedium. Verschillende werkwijzen zijn tot nu toe beschreven, die gebaseerd zijn op ultracentrifugatie 1, industrieel scheiding reagentia (zoals Exoquick) 7, magnetische partikels voor antigeen gebruik afscheiding 8 of ultrafiltratie stap 9.
In dit protocol tonen we het gehele proces van exosome isolatie via ultracentrifugatie en tonen hoe de verkregen exosoom suspensie via het deeltje volgen instrument te analyseren. Specifieke overwegingen voor de analyse van menselijk plasma of celkweekmedium afgeleide exosomes voorzien.
Protocol
Representative Results
Discussion
We tonen een gedetailleerd protocol voor exosome isolatie van bloed en het heden nanodeeltjes volgen als een nieuwe en innovatieve methode om exosome omvang en concentratie te meten in een biologische vloeistof. In de gepresenteerde experimenten werd humaan perifeer bloed als de oorsprong van de exosomes. Echter, andere oorsprong, zoals urine, sputum, celkweeksupernatant, etc., kunnen ook worden gebruikt als testmateriaal.
Op basis van de biologische variabiliteit van exosome concentratie bij mensen, kunnen analyses van verschillende individuen opvallend verschillende concentraties van exosomes kenmerken. Echter, de concentratie van deeltjes in de biologische test sonde invloed op de resultaten. Daarom is een betrouwbare en gestandaardiseerde procedure voor de verdunning van probes nodig. In de gepresenteerde methode exosome bevattende plasma gegenereerd uit 9 ml van perifeer volbloed. Met differentiële centrifugatie stappen een exosome pellet werd geïsoleerd uit1 ml plasma en opnieuw gesuspendeerd in 5 ml gedestilleerd water om te resulteren in de werking monster gesuspendeerd exosomes. Deze voorgedefinieerde instelling heeft ons voorzien van een goede concentratie van deeltjes, dat wil zeggen, de juiste scatter intensiteit tijdens de NTA. Naast het aspect volume en verdunning, de samenstelling van de oplossingen die worden gebruikt ook van belang. We hebben gedestilleerd water gebruikt voor de uiteindelijke re-opschorting van exosomen. Natuurlijk verschillende media voor de laatste verdunningsstap kunnen ook worden gebruikt, volgens de eisen van de experimentele opstelling. In het geval van zeta potentiaal metingen van ionische oplossingen, vooral bij het testen monsters met een buffercapaciteit, een voorzichtige verdunning in turbulentievrije omstandigheden nuttig. Voor de directe vergelijking van meerdere monsters aanbeveling het dezelfde verdunning niveau voor alle monsters. Alle instellingen behalve de gevoeligheid en de videoresolutie kan achteraf worden gewijzigd met behulp van de ZetaView Analysis software.
<p class="Jove_content"> Hoewel de auteurs zijn van mening dat de hier geïntroduceerde systeem is op dit moment het meest geschikte instrument, het is niet de enige beschikbare NTA systeem. Een aantal eerdere rapporten hebben andere systemen die dezelfde NTA principes toe te passen, maar bieden een ander instrument ontwerp dat gaat samen met een aantal verschillende functies 10 in dienst. Wij zijn van mening dat de praktische aspecten met betrekking tot het behandelen van het monster en de reproduceerbaarheid van de resultaten zijn van cruciaal belang bij het kiezen van de methodologische volgorde voor exosome evaluatie. We geloven ook dat een ideaal detectiesysteem user-afhankelijk factoren die kunnen interfereren met de resultaten van de metingen te elimineren. De exosome analyse aanpak die hier gepresenteerd voldoet aan het criterium van gebruiksgemak hoge mate. Als een verder voordeel wordt de semi-automatische analyse van de monsters uitgevoerd in een snel proces, genereren resulteert in een korte tijd. Een online visualisatie van exosomen helpt de analysator te GAin een oogwenk idee van de exosome kenmerken, bijvoorbeeld, bruto concentratie.Een zeer eenvoudige doch elegante aanvulling op de meettechniek hier gepresenteerde is het gebruik van gelabeld antilichaam exosomes en het vastleggen van de verstrooide laserbundel met een voorafgaand filter voor de detector. Zo kan exosome subpopulaties worden onderscheiden naar hun oppervlak antigenen en andere biologisch relevante kenmerken die technisch toegankelijke selectief fluorescerende kleuring zijn.
Een nadeel van de huidige versie van onze deeltje volgen instrument is dat bij zeer hoge gevoeligheid niveaus artefacten zoals ruis aanwezig kan zijn, die is gebaseerd op de cel kanaalwand. Een technische oplossing en de verbetering van het huidige systeem beschikbaar kan komen in de nabije toekomst. Met deze werkwijze reflecties van de laser strooilicht op de kanaalwand wordt verminderd, waardoor de de nauwkeurigheid van de gemeten signalen en verkregen gegevens en verlagen de detectiegrens.
Hoewel de momenteel gebruikte protocol voor exosome isolatie is goed ingeburgerd en de toegepaste deeltjes volgen instrument heeft een opmerkelijk nauwkeurige resolutie lager grootteverdeling van 30 nm, is er geen garantie dat de gedetecteerde deeltjes inderdaad helemaal waar exosomes. Andere deeltjes, zoals dode cellen fragmenten of groter eiwit complexen kunnen ook in de exosoom suspensie en leiden tot vals positieve signalen. Een betrouwbare methode waarmee dergelijke "vervuiling" kunnen worden uitgesloten elektronenmicroscopie (EM), ofwel transmissie EM of scannen EM zijn. Helaas, geen algemene en specifieke marker voor exosomen tot dusver geïdentificeerd, hoewel een aantal van de eerder voorgestelde oppervlakte markers hebben opgedaan een toenemende hoeveelheid aandacht, waaronder tetraspanine (tspan), CD81, C63, CD9, enz. 11.
"> Ongeacht de toekomstige vooruitgang onderzoek naar exosome biologie, met name betreffende exosome specifieke markers, het protocol dat hier wordt voorgesteld een krachtige werkwijze voor de isolatie en detectie van exosomes verschaffen. Concentratie en grootte gemakkelijk bepaald worden in een software-ondersteunde ongecompliceerde mode. De toevoeging van selectieve fluorescerende markers of fluorfoor gekoppeld antilichamen zal waarschijnlijk verder verbeteren van de mogelijke toepassingen van de gepresenteerde aanpak van de NTA.Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
Riferimenti
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
