V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting
Summary
V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.
Abstract
De westerse vlek is een zeer nuttige en wijdverbreide laboratoriumtechniek, maar de uitvoering ervan is uitdagend. De workflow wordt vaak gekenmerkt als een “black box” omdat een experimentalist niet weet of het met succes is uitgevoerd tot de laatste van verschillende stappen. Bovendien wordt de kwaliteit van westerse vlekgegevens soms uitgedaagd vanwege een gebrek aan effectieve kwaliteitscontroletools in het hele westerse blotting-proces. Hier beschrijven we de V3-westerse workflow, die vlekvrije technologie toepast om de belangrijkste problemen in verband met het traditionele westerse vlekprotocol aan te pakken. Deze workflow stelt onderzoekers in staat: 1) om een gel in ongeveer 20-30 minuten uit te voeren; 2) om steekproefscheidingskwaliteit binnen 5 min na de gelloop te visualiseren; 3) om eiwitten over te brengen in 3-10 min; 4) om de overdrachtsefficiëntie kwantitatief te verifiëren; en vooral 5) om veranderingen in het niveau van het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitbelastingscontrole. Deze nieuwe aanpak elimineert de noodzaak van het strippen en opnieuw berispen van de vlek voor huishoudelijke eiwitten zoals β-actine, β-tubuline, GAPDH, enz. De V3-vlekvrije workflow maakt het westerse vlekproces sneller, transparanter, kwantitatiever en betrouwbaarder.
Introduction
Western vlek is een zeer nuttige techniek9, maar er zijn twee grote uitdagingen met western blotting: lang en arbeidsintensief proces en kwaliteit van gegevens. Een traditioneel protocol vereist ongeveer 2 dagen. Het omvat vele stappen, waaronder monstervoorbereiding, gelgieten, eiwitelektroforese en overdracht, membraanblokkering gevolgd door antilichaam incubatie, beeldvorming en heel vaak strippen, reprobing en ten slotte gegevensanalyse. Gedurende dit hele proces zijn er geen betrouwbare en flexibele tools voor procesbesturing. Als zodanig kunnen fouten bij elke stap worden geïntroduceerd en deze fouten kunnen gegevensartefacten genereren; daarom zijn beladingscontroles essentieel bij western blotting om de fouten te identificeren en te corrigeren. De beladingscontrole wordt meestal uitgevoerd door het eiwitniveau van een referentie-eiwit in elk monster te controleren om te zien of het gelijk wordt gepresenteerd. Mensen gebruiken vaak huishoudelijke eiwitten, zoals β-actine, β-tubuline, GAPDH, als beladingscontrole.
De kwaliteit van westerse vlekgegevens is afhankelijk van betrouwbare beladingscontrole. Maar er zijn twee legitieme zorgen bij het gebruik van huishoudelijke eiwitten voor belastingscontroles: 1) de op antilichamen gebaseerde immunodetection van de huishoudelijke eiwitbanden is vaak verzadigd en daarom kan men de belastingsverschillen tussen de monsters niet onderscheiden30; 2) het niveau van de huishoudingeiwitexpressie kan in de steekproeven onder bepaalde experimentele voorwaarden variëren, bijvoorbeeld siRNA behandeling, celdood, celdifferentiatie, enz.11,28,3,6,10,21. Vanwege deze zorgen eisen wetenschappelijke tijdschriften nu dat “voor kwantitatieve vergelijkingen geschikte reagentia, controles en beeldvormingsmethoden met lineaire signaalbereiken moeten worden gebruikt” (Natuurrichtlijn). Evenzo vragen redacteuren van het Journal of Clinical Investigation om betrouwbaardere beladingscontroles24. Om deze redenen moet een huishoudelijk eiwit worden gevalideerd om te kunnen worden gebruikt als beladingscontrole. Ten eerste moet men ervoor zorgen dat het wordt gemeten in het lineaire dynamische bereik van de immunodetectionmethode14,29. Ten tweede moet men ervoor zorgen dat het consistent wordt uitgedrukt in alle monsters26,31,25,19,20.
Een alternatieve oplossing voor een betrouwbare beladingsregeling is het gebruik van totale eiwitmeting van de vlek. Sommige onderzoekers hebben de vlekken gekleurd met totale eiwitvlekken, zoals Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S en vlekvrije technologie, om het totale eiwitsignaal in elke rijstrook te meten als beladingscontrole16,20,13,27,1,4,12. De totale eiwitbelastingscontrole vermijdt de valkuilen die gepaard gaan met huishoudelijke eiwitten. Ten eerste is het een echte weerspiegeling van de hoeveelheid eiwit die voor elk monster wordt geladen. Ten tweede vertoont de totale eiwitvlek een uitstekend lineair dynamisch bereik in het gemeenschappelijke laadbereik voor westerse vlekanalyse (10-50 μg eiwit van een complex cellysaat) en onderscheidt nauwkeurig het belastingsverschil tussen de monsters12.
Vlekvrije technologie is een nieuwe totale eiwitkleuringsmethode waarbij een unieke verbinding wordt gemengd in acrylamidegeloplossing en gelijkmatig wordt verdeeld in de gegoten gel. Nadat elektroforese is voltooid, wordt de gel minimaal 1 minuut blootgesteld aan UV-licht, zodat de vlekverbinding reageert met de tryptofaanresten in het eiwit. De eiwitten worden prikkelbaar onder UV-licht om een sterk fluorescerend signaal te geven dat kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd in een vlekvrije beeldschrijver zoals het ChemiDoc MP-systeem. De vlekvrije verbinding zelf absorbeert echter geen UV-licht, wat resulteert in een lage achtergrond van het gelbeeld. De modificatie van de tryptofaanresten is onomkeerbaar en eiwitten kunnen niet alleen in de gel worden gevisualiseerd, maar ook op de vlek op elk moment na eiwitoverdracht.
De vlekvrije technologie wordt toegepast in de V3 Western Workflow (figuur 1) om de belangrijkste klachten over de traditionele workflow aan te pakken, met name de zorgen over het gebruik van huishoudelijke eiwitten als beladingscontrole. Met behulp van deze workflow kan men: 1) een gel uitvoeren in ongeveer 20-30 minuten, 2) de integriteit van het monster en de kwaliteit van de eiwitscheiding controleren in 5 minuten na het lopen van de gel; 3) breng eiwitten over in 3-10 min; 4) controleer de overdrachtsefficiëntie kwantitatief; en 5) het belangrijkste, valideer veranderingen in het niveau van het eiwit van belang met behulp van totale eiwitbelastingscontrole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierboven beschreven V3-vlekvrije protocol is voor multiplexing fluorescerende westernblotting. Het kan ook worden toegepast in westerse blotting met behulp van chemiluminescente detectie. In het multiplex fluorescerende western blot protocol worden de vlekvrije vlekbeelden op twee tijdstippen verkregen: 1) direct na eiwitoverdracht; 2) bij de multiplex fluorescente beeldvorming stap na antilichaam incubatie. De eerste vlekvrije afbeelding wordt gebruikt om de overdrachtsefficiëntie te berekenen en de tweede vlekvrije afbeelding wordt gebruikt als beladingscontrole. Wanneer de chemiluminescente methode wordt toegepast, is het niet mogelijk om een multiplexbeeld te maken voor de vlekvrije en doeleiwitsignalen, omdat het chemiluminescente signaal ook in het vlekvrije kanaal zal verschijnen. In dit geval raden we aan om de vlekvrije afbeelding direct na de eiwitoverdrachtstap te gebruiken voor belastingscontrole en normalisatieanalyse.
De V3 western workflow biedt de volgende unieke voordelen ten opzichte van de traditionele western blot workflow die huishoudelijke eiwitten gebruikt als laadregelaars:
Ten eerste biedt de V3-workflow een praktische, handige en betrouwbaardere beladingsregeling om de veranderingen in het niveau van het eiwit van belang te valideren. Het V3-protocol maakt gebruik van een totale eiwitbelastingsregeling om het niveau van het interesseeiwit, gemeten in elk monster, te normaliseren. Het vermijdt twee valkuilen van het gebruik van de huishoudelijke eiwitten als belastingscontroles: verzadigde immunodetection en inconsistente expressieniveaus van huishoudelijke eiwitten onder de monsters onder bepaalde experimentele omstandigheden. Strippen en reprobing stappen met antilichamen gericht tegen het huishouden zijn niet langer nodig. Met behulp van vlekvrije technologie is het niet nodig om een vlek te beitsen en te de-beitsen met vlekken zoals Coomassie of Sypro Ruby voor totale eiwitmeting. Het duurt slechts een paar seconden om een vlekafbeelding te verkrijgen en ongeveer 5 minuten om totale eiwitnormalisatie uit te doen met behulp van Image Lab-software.
Ten tweede stelt de V3-workflow wetenschappers in staat om de westerse procedure beter te controleren, omdat het de procedure transparanter maakt en verschillende controlepunten voor kwaliteitscontrole introduceert. Met behulp van vlekvrije technologie kunnen onderzoekers hun eiwitmonsters visualiseren op zowel de gel als de vlek. Wetenschappers kunnen de integriteit van eiwitmonsters (gedegradeerd of niet), scheidingskwaliteit (al dan niet neergeslagen), overdrachtsefficiëntie en overdrachtskwaliteit (zelfs overdracht of niet) beoordelen. Deze controlepunten helpen onderzoeken het experiment te beëindigen bij het zien van grote gebreken in het proces en voorkomen dat ze tijd verspillen aan slechte monsters en vlekken. Deze technologie helpt wetenschappers ook te beoordelen of er een aanzienlijke hoeveelheid eiwitverlies is na het strippen van het membraan en of de vlek geschikt is voor het weerleggen van een ander doel 4.
Hier zijn een paar tips om een goede ervaring en kwaliteitsgegevens te garanderen met behulp van V3 western workflow.
- Afbeelding van de gel onmiddellijk na gel run. Week de gel niet in een buffer vóór de eerste beeldvorming in de procedure, omdat deze de vlekverbinding kan wegspoelen.
- Gebruik hetzelfde beeldgebied om alle afbeeldingen in het protocol te verkrijgen. Hierdoor kan de software afbeeldingen overlappen voor gegevensanalyse, zoals totale eiwitnormalisatie.
- Houd de belichtingstijd consistent bij het in beeld brengen van de pretransfer- en posttransfergels. Hierdoor kan de software de overdrachtsefficiëntie kwantitatief meten.
- Houd het membraan nat met een paar druppels water of TBST bij het verkrijgen van het vlekbeeld. Dit voorkomt mogelijke vuile achtergrondproblemen voor doeleiwitdetectie.
- Gebruik een laag fluorescerend PVDF-membraan voor multiplexing fluorescerende westelijke blotting.
Het is belangrijk op te merken dat het vlekvrije molecuul na UV-activering onomkeerbaar gebonden is aan tryptofaanresten. Deze onomkeerbare modificatie kan mogelijk van invloed zijn op de herkenning van antigeen bij het gebruik van monoklonale antilichamen als de epitoop tryptofaan bevat. Polyklonale antilichamen zullen waarschijnlijk niet worden aangetast omdat ze meerdere epitopen op het antigeen herkennen. Ongebonden vlekvrije moleculen kunnen gemakkelijk van de gel en het membraan worden gewassen en zullen daarom de antilichaam-antigeeninteracties niet verstoren.
Kortom, de V3 western workflow maakt het western vlek proces sneller, transparanter, kwantitatiever en betrouwbaarder. Onderzoekers kunnen nu eenvoudig totale eiwitbelastingscontrole toepassen in een westers vlekexperiment om hun gegevens betrouwbaarder te maken. De V3-vlekvrije workflow is overgenomen door een aantal laboratoria en hun publicaties hebben aangetoond dat tijdschriften vlekvrije gegevens accepteren als beladingscontrole in western blot22,17,7,8,5,23,18,15.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi en Jeff Durban voor hun kritische beoordeling en bewerking van dit manuscript. De auteurs bedanken allison Schwartz ook voor de technische ondersteuning.
Materials
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |
Riferimenti
- Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).
- Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).
- Castaño, Z., Kypta, R. M. Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation. Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).
- Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).
- Dittmer, A., Dittmer, J. Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).
- Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).
- Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).
- Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis. Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).
- Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis. Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).
- Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage. DNA Repair. , (2013).
- Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark. Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).
- Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).
- Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian. , (2012).
- Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting. J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).
- Liu, N. K., Xu, X. M. Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).
- Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans. J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).
- Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. . Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).
- Neill, U. S. All Data are not created Equal. J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).
- Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).
- Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro. BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).
- Welinder, C., Ekblad, L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).
- You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease. Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).
