ウェスタンブロッティングにおける実用的で便利で信頼性の高い全タンパク質ローディング制御のためのV3染色不要のワークフロー
Summary
V3ワークフローは、染色フリーゲルを使用したウェスタンブロット手順です。この染色フリー技術により、研究者はタンパク質分離の質を可視化し、転写効率を検証し、最も重要なのは、信頼性の高いローディングコントロールとしてタンパク質の総定量を使用して目的のタンパク質の変化を検証することが可能です。
Abstract
ウェスタンブロットは非常に有用で広く採用されているラボ技術ですが、その実行は困難です。実験者は、それがいくつかのステップの最後まで正常に実行されたかどうかを知らないので、ワークフローはしばしば「ブラックボックス」として特徴付けられます。さらに、ウェスタンブロットのデータの品質は、ウェスタンブロッティングプロセス全体で効果的な品質管理ツールが不足しているため、時には挑戦されます。ここでは、従来のウェスタンブロットプロトコルに関連する主要な懸念事項に対処するために、汚れのない技術を適用するV3 westernワークフローについて説明します。このワークフローは研究者を可能にする:1)約20〜30分でゲルを実行する。2)ゲルの実行後5分以内にサンプル分離品質を可視化する。3)3-10分でタンパク質を移す。4)転送効率を定量的に検証する。そして最も重要な5)総タンパク質負荷制御を使用して関心のあるタンパク質のレベルの変化を検証する。この新しいアプローチは、βアクチン、βチューブリン、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質のブロットを除去して再探査する必要 を排除しますV3 染色フリーワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、透明、より定量的で信頼性の高いものにします。
Introduction
ウェスタンブロットは非常に便利な技術9ですが、ウェスタンブロッティングには長くて労働集約的なプロセスとデータの質という2つの大きな課題があります。従来のプロトコルは約2日を要します。サンプル調製、ゲルキャスティング、タンパク質電気泳動および転写、膜遮断、抗体インキュベーション、イメージング、そして非常に頻繁に剥離、再探査、および最後のデータ分析を含む多くのステップが含まれます。このプロセスを通して、プロセス制御のための信頼性と柔軟性のあるツールはありません。そのため、各ステップでエラーが発生する可能性があり、これらのエラーはデータアーティファクトを生成する可能性があります。したがって、ローディングコントロールは、エラーを識別して修正するために、ウェスタンブロッティングで不可欠です。ローディング制御は通常、各サンプルの参照タンパク質のタンパク質レベルをチェックして、それが等しく提示されているかどうかを確認することによって行われます。人々はしばしば、β-アクチン、β-tubulin、GAPDHなどのハウスキーピングタンパク質をローディングコントロールとして使用します。
ウェスタンブロットデータの品質は、信頼性の高いローディング制御に依存します。しかし、ローディングコントロールにハウスキーピングタンパク質を使用する場合には、2つの正当な懸念があります:1)ハウスキーピングタンパク質バンドの抗体ベースの免疫検出はしばしば飽和しているため、サンプル30の間の負荷の違いを区別することはできません。2)ハウスキーピングタンパク質発現量は、ある特定の実験条件下でサンプル中で変化し得るが、例えば、siRNA処理、細胞死、細胞分化、11、28、3、6、10、21などである。これらの懸念から、科学雑誌は「定量的比較のために、適切な試薬、制御および線形信号範囲を用いるイメージング法を使用すべきである」(Natureガイドライン)を要求している。同様に、臨床調査のジャーナルからの編集者は、より信頼性の高いローディングコントロール24を求めています。これらの理由から、ローディングコントロールとして使用するためにハウスキーピングタンパク質を検証する必要があります。まず、免疫検出方法14,29の線形ダイナミックレンジで測定されていることを確認する必要がある。第二に、すべてのサンプル26,31,25,19,20で一貫して表現されていることを確認する必要があります。
信頼性の高いローディング制御に代わる解決策は、ブロットからの総タンパク質測定を使用することです。一部の研究者は、クーマシー、フラミンゴピンク、シプロルビー、アミドブラック、ポンソーS、および汚れのない技術などの総タンパク質汚れでブロットを染色し、各レーンの総タンパク質シグナルをローディングコントロール16,20,13,27,1,4,12として測定しています。総タンパク質ローディング制御は、ハウスキーピングタンパク質に関連する落とし穴を回避します。まず、各サンプルに対してロードされるタンパク質の量を真に反映したものである。第2に、全タンパク質染色は、ウェスタンブロット分析のための共通のローディング範囲(複雑な細胞ライセートの10〜50μgタンパク質)において優れた線形ダイナミックレンジを示し、サンプル12間の負荷差を正確に区別する。
染色フリー技術は、アクリルアミドゲル溶液にユニークな化合物を混合し、キャストされたゲルに均等に分布する新規の全タンパク質染色法です。電気泳動が完了した後、ゲルは最低1分間UV光にさらされ、染色化合物がタンパク質中のトリプトファン残基と反応するようになる。タンパク質はUV光下で興奮し、ChemiDoc MPシステムのような染色を含まないイメージャーで視覚化および定量することができる強力な蛍光シグナルを与えます。しかし、染色を含まない化合物自体はUV光を吸収せず、ゲル画像の背景が低くなる。トリプトファン残基の修飾は不可逆的であり、タンパク質はゲルだけでなく、タンパク質の転写後いつでもブロット上で視覚化することができます。
この染色を含まない技術は、V3 Western ワークフロー (図 1)に適用され、従来のワークフローに関する主な不満、特にローディング コントロールとしてのハウスキーピングタンパク質の使用に関する懸念事項に対処します。このワークフローを使用すると、1)約20〜30分でゲルを実行し、2)ゲルラン後5分でサンプルの完全性とタンパク質分離品質をチェックすることができます。3)3-10分でタンパク質を移動します。4)転送効率を定量的に確認してください。そして5)最も重要なことは、総タンパク質負荷制御を使用して、目的のタンパク質のレベルの変化を検証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のV3染色フリープロトコルは、蛍光ウェスタンブロッティングを多重化するためのものである。また、化学発光検出を用いたウェスタンブロッティングにも適用できる。多重蛍光ウェスタンブロットプロトコルでは、染色のないブロット画像は、2つの時点で取得されます:1)タンパク質の転写直後。2)抗体インキュベーション後の多重蛍光イメージング工程で。第1の染色自由画像は、転写効率を計算するために使用され、第2の染色自由画像は、負荷制御として使用される。化学発光法を適用すると、染色無発光シグナルも染色フリーチャネルに現れるため、染色フリーおよびターゲットタンパク質シグナルの多重化画像を撮ることは不可能です。この場合、タンパク質転写工程直後に撮影した染色のない画像を、ローディング制御および正規化解析に使用することを推奨します。
V3 western ワークフローは、ロード制御としてハウスキーピングタンパク質を使用する従来のウェスタン ブロット ワークフローと比較して、次のような独自の利点を提供します。
まず、V3ワークフローは、実用的で便利で信頼性の高いローディング制御を提供し、目的のタンパク質のレベルの変化を検証します。V3プロトコルは、各サンプルで測定された対象タンパク質のレベルを正規化するために、総タンパク質負荷制御を使用します。これは、ローディングコントロールとしてハウスキーピングタンパク質を使用する2つの落とし穴を回避します: 飽和免疫検出と特定の実験条件下でのサンプル間の一貫性のないハウスキーピングタンパク質の発現レベル。ハウスキーピングに対する抗体を用いたストリッピングとリプロブステップは不要になりました。染色フリー技術を使用すると、タンパク質の全測定にクーマシーやシプロルビーなどの汚れでブロットを汚して脱染色する必要はありません。イメージラボソフトウェアを使用して全タンパク質の正規化を行うには、ブロット画像を取得するのにわずか数秒、約5分かかります。
第二に、V3ワークフローは、手順をより透明にし、品質管理のためのいくつかのチェックポイントを導入するので、科学者が西洋の手順のより良い制御を取ることを可能にします。染色フリー技術の助けを借りて、研究者はゲルとブロットの両方でタンパク質サンプルを視覚化することができます。科学者は、タンパク質サンプルの完全性(分解されたかどうか)、分離品質(沈殿または沈殿しない)、伝達効率と転送品質(転送または転送しない)を評価することができます。これらのチェックポイントは、研究がプロセスに大きな欠陥を見たときに実験を終了し、貧弱なサンプルやブロットに時間を無駄にしないようにするのに役立ちます。この技術はまた、科学者が膜剥離後にかなりの量のタンパク質損失があるかどうか、およびブロットが別の標的 4を再探査するのに適しているかどうかを評価するのに役立ちます。
ここでは、V3 Western ワークフローを使用して優れたエクスペリエンスと品質データを確保するためのヒントをいくつか紹介します。
- ゲルを実行した直後にゲルをイメージします。汚れ化合物を洗い流す可能性があるため、手順の最初のイメージングの前にゲルを任意のバッファーに浸漬しないでください。
- 同じイメージング領域を使用して、プロトコル内のすべてのイメージを取得します。これにより、ソフトウェアは、総タンパク質正規化などのデータ分析のための画像をオーバーレイすることができます。
- 事前転写ゲルと転写後ゲルを撮像する際の露光時間を一貫して保ちます。これにより、ソフトウェアは転送効率を定量的に測定できます。
- ブロット画像を取得する際には、数滴の水またはTBSTで膜を濡らしてください。これにより、標的タンパク質検出に関する汚れた背景の問題を回避できます。
- 蛍光性ウェスタンブロッティングの多重化には低蛍光PVDF膜を使用してください。
UV活性化後の染色を含まない分子はトリプトファン残基に不可逆的に結合することに注意することが重要である。この不可逆的な修飾は、エピトープにトリプトファンが含まれている場合、モノクローナル抗体を使用する場合に抗原認識に影響を与える可能性があります。ポリクローナル抗体は、抗原上の複数のエピトープを認識するため、影響を受ける可能性は低い。結合されていない染色を含まない分子は、ゲルや膜から容易に洗い流されるため、抗体と抗原の相互作用を妨げない。
結論として、V3 Westernワークフローは、ウェスタンブロットプロセスをより速く、より透明で、定量的で信頼性が高くなります。研究者は、ウェスタンブロット実験で総タンパク質負荷制御を簡単に適用して、データをより信頼できるようにすることができます。V3染色フリーのワークフローは、多くのラボで採用されており、その出版物は、ジャーナルがウェスタンブロット22,17,7,8,5,23,18,15のローディング制御として汚れのないデータを受け入れることを実証しています。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ウルフ・ディーター・スターツ博士、アルノー・レミー博士、アントン・ポッシュ博士、パトリシア・ピアッティ博士、トム・デイヴィス、クリス・シモニー、ジェフ・ダーバンがこの原稿の批判的なレビューと編集に感謝しています。著者らはまた、アリソン・シュワルツの技術サポートに感謝しています。
Materials
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |
Riferimenti
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