In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau
Summary
la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.
Abstract
La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l'une des principales niches neurogène dans le cerveau postnatal. Ici, cellules progénitrices neurales prolifèrent et donnent lieu à des neuroblastes capables de se déplacer le long de la courant de migration rostrale (RMS) vers le bulbe olfactif (OB). Cette migration de longue distance est nécessaire pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones dans l'OB, mais les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus sont encore peu claires. Enquêter sur les voies de signalisation contrôlant neuroblastes motilité peut non seulement aider à comprendre une étape fondamentale dans la neurogenèse, mais aussi avoir un potentiel de régénération thérapeutique, compte tenu de la capacité de ces neuroblastes de cibler des sites cérébrales affectées par une blessure, accident vasculaire cérébral, ou dégénérescence.
Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé pour in vivo électroporation postnatal et après imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le RMS de la souris. Électroporation postnatale peut efficacement transfecter SVZ ancêtrecellules, qui à leur tour, les neuroblastes qui migrent le long des RMS. Confocale disque en rotation time-lapse microscopie sur des cultures de tranches de cerveau de courte durée, la migration des neuroblastes peut être contrôlée dans un environnement ressemblant étroitement à la condition in vivo. En outre, neuroblaste motilité peut être suivi et analysé quantitativement. A titre d'exemple, nous décrivons comment utiliser in vivo postnatale électroporation d'un plasmide exprimant la GFP d'étiqueter et de visualiser les neuroblastes qui migrent le long des RMS. L'électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant chez la souris knock-out conditionnel qui emploient le système de LoxP peut également être utilisé pour cibler des gènes d'intérêt. Manipulation pharmacologique des cultures de tranches de cerveau aiguë peut être effectuée pour étudier le rôle des différentes molécules de signalisation dans la migration des neuroblastes. En couplant électroporation in vivo avec imagerie time-lapse, nous espérons comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la motilité neuroblastes et contribuer au développementment de nouvelles approches pour favoriser la réparation du cerveau.
Introduction
Dans le cerveau des mammifères, la génération de nouveaux neurones (neurogenèse) commence après la naissance principalement dans deux régions, la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire dans le gyrus denté de l'hippocampe 1. Des preuves considérables recueillies au cours des dernières années prend en charge un rôle essentiel pour la neurogenèse postnatale dans les fonctions de mémoire de l'ampoule de l'hippocampe et olfactives 1-3. Surtout, la neurogenèse postnatale est également titulaire d'un potentiel thérapeutique en raison de sa relation avec les troubles neurologiques dégénératives, et la capacité des neuroblastes à migrer vers les sites blessés dans le cerveau 4-6.
La zone sous-ventriculaire (SVZ) a récemment émergé comme une niche neurogène crucial. Neuroblastes SVZ dérivés migrent vers le bulbe olfactif (OB) via le courant de migration rostrale (RMS), ce qui en fait le plus long processus de migration dans le cerveau 1,7,8 postnatale. Le / RMS / système de OB mammifère SVZ est devenu unmodèle utile pour étudier les différentes étapes de la neurogenèse, tels que la prolifération, la migration et la différenciation 1,8. Beaucoup de facteurs de croissance et signaux extracellulaires régulent la neurogenèse SVZ et migration le long des RMS, mais les mécanismes moléculaires intracellulaires sont loin d'être pleinement compris 1,9. Migration correcte le long des RMS est essentiel pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones 10. En outre, certaines études ont montré que les neuroblastes SVZ dérivés peuvent migrer hors des RMS aux sites de lésions cérébrales 4-6,11-13. Ainsi, l'enquête de la migration des neuroblastes mécanismes de signalisation de régulation est fondamental non seulement pour comprendre la neurogenèse, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour marquer progéniteurs neuronaux SVZ par électroporation postnatale in vivo et de suivre leur migration le long des RMS dans les cultures de tranches de cerveau de courte durée en utilisant time-lapse disque rotatif confocale microscopy. L'électroporation est largement utilisé dans les études de développement de l'embryon à stade adulte 14-18. Il est un outil puissant pour cibler et manipuler progéniteurs neuronaux SVZ et représente une alternative moins coûteuse et beaucoup plus rapide à l'injection stéréotaxique de vecteurs viraux ou génération de modèles transgéniques 1,15,19,20. Il s'agit d'un procédé relativement simple qui ne nécessite pas une intervention chirurgicale et a des taux de survie élevés. Électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant dans les modèles génétiques de souris qui emploient le système loxP peut être utilisé pour cibler des gènes d'intérêt ou de réaliser l'étiquetage permanent des progéniteurs SVZ, ce qui représente un outil utile pour les études de la neurogenèse adulte 21,22.
Imagerie RMS migration des neuroblastes dans le cerveau intact est encore difficile en raison de limitations techniques actuelles. Toutefois, ce processus peut être contrôlé à l'aide confocale à disque rotatif time-lapse microscopie de tranches de cerveau de courte durée, qui fournissent un syst appropriélui ressemblant étroitement à la condition in vivo aussi prêtent à la manipulation pharmacologique 23,24. Couplage dans électroporation postnatale vivo avec imagerie time-lapse facilitera la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant neuroblastes motilité et contribuer au développement de nouvelles approches pour promouvoir la réparation du cerveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migration efficace de cellules progénitrices neurales le long des RMS assure leur maturation ultérieure en neurones fonctionnels 10. Flux importants de progéniteurs neuronaux dirigés vers l'OB sont visibles dans l'enfance humaine et sont susceptibles de jouer un rôle important au début postnatal le développement du cerveau humain 27. De plus, ces cellules sont capables de cibler des sites du cerveau affectées par une lésion et la neurodégénérescence 4,28. Être capabl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS et YZ sont pris en charge par KCL KCL et la Chine bourses de doctorat. MO a été financée par une bourse d'études de doctorat en biotechnologie et Conseil de recherches en sciences biologiques. Nous remercions Masaru Okabe et Jun-ichi Miyazaki pour le plasmide pCX-EGFP et Alain Chedotal et Athena Ypsilanti pour de précieux conseils sur l'électroporation.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
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