In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda
Summary
La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.
Abstract
La zona subventricular (SVZ) es uno de los principales nichos neurogénicos en el cerebro postnatal. Aquí, progenitores neurales proliferan y dan lugar a neuroblastos capaces de moverse a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) hacia el bulbo olfatorio (OB). Se requiere esta migración de larga distancia para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas en el OB, pero los mecanismos moleculares que regulan este proceso aún no están claros. La investigación de las vías de señalización que controlan la motilidad neuroblastos no sólo puede ayudar a entender un paso fundamental en la neurogénesis, pero también tienen el potencial de regeneración terapéutica, dada la capacidad de estos neuroblastos en los sitios diana del cerebro afectadas por una lesión, accidente cerebrovascular, o degeneración.
En este manuscrito se describe un protocolo detallado para la electroporación in vivo postnatal y la posterior time-lapse de la migración de los neuroblastos en el RMS ratón. Electroporación postnatal puede transfectar eficazmente SVZ progenitorcélulas, que a su vez generan neuroblastos migran a lo largo de la RMS. El uso de disco giratorio confocal time-lapse microscopía en cultivos de cortes cerebrales agudos, la migración de los neuroblastos se puede controlar en un ambiente muy parecido al estado in vivo. Por otra parte, la movilidad de los neuroblastos pueden ser rastreados y analizados cuantitativamente. A modo de ejemplo, se describe cómo utilizar la electroporación in vivo después del parto de un plásmido GFP-expresando etiquetar y visualizar los neuroblastos migran a lo largo de la RMS. La electroporación de plásmidos que expresan recombinasa CRE shRNA o en ratones knock-out condicionales que emplean el sistema LoxP también se puede utilizar para apuntar a los genes de interés. La manipulación farmacológica de cultivos de cortes cerebrales agudos se puede realizar para investigar el papel de las diferentes moléculas de señalización en la migración de los neuroblastos. Mediante el acoplamiento de la electroporación in vivo con time-lapse, esperamos comprender los mecanismos moleculares que controlan la motilidad de los neuroblastos y contribuir al desarrollo deción de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.
Introduction
En el cerebro de los mamíferos, la generación de nuevas neuronas (neurogénesis) se produce después del nacimiento principalmente en dos regiones, la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la zona subgranular en el giro dentado del hipocampo 1. Considerable evidencia reunida en los últimos años destaca el papel primordial para la neurogénesis postnatal en funciones de la memoria del hipocampo y el bulbo olfatorio 1-3. Es importante destacar que la neurogénesis postnatal también tiene potencial terapéutico debido a su relación con los trastornos neurológicos degenerativos, y la capacidad de los neuroblastos a migrar a sitios de heridas en el cerebro 4-6.
La zona subventricular (SVZ) ha surgido recientemente como un nicho neurogénico crucial. Neuroblastos derivados de SVZ migran hacia el bulbo olfatorio (OB) a través de la corriente migratoria rostral (RMS), haciendo de este el proceso de migración más largo del 1,7,8 cerebro postnatal. El / RMS / sistema OB de mamíferos SVZ se ha convertido en unmodelo útil para estudiar los diferentes pasos en la neurogénesis, como la proliferación, migración y diferenciación de 1,8. Muchos factores de crecimiento y señales extracelulares regulan la neurogénesis ZVS y la migración a lo largo de la RMS, pero los mecanismos moleculares intracelulares están lejos de ser plenamente entendidos 1,9. Migración correcta a lo largo de la RMS es crucial para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas 10. Además, algunos estudios han demostrado que los neuroblastos derivados de SVZ pueden migrar fuera de los RMS a los sitios de lesión cerebral 4-6,11-13. Por lo tanto, la investigación de la migración de los neuroblastos mecanismos de señalización de regulación es fundamental no sólo para entender la neurogénesis, sino también para aplicaciones terapéuticas potenciales.
Aquí se describe un protocolo detallado para etiquetar progenitores neurales SVZ por electroporación in vivo después del parto y vigilar su migración a lo largo de los RMS en cultivos de cortes cerebrales agudos utilizando time-lapse confocal de disco giratorio microscópicapy. La electroporación es ampliamente utilizado en los estudios de desarrollo de embriones a los estadios adultos de 14-18. Es una poderosa herramienta para orientar y manipular progenitores neurales SVZ y representa una alternativa más barata y mucho más rápida que la inyección estereotáxica de vectores virales o generación de modelos transgénicos 1,15,19,20. Se trata de un procedimiento relativamente simple que no necesita cirugía y tiene altas tasas de supervivencia. Electroporación de shRNA o plásmidos que expresan recombinasa CRE en los modelos genéticos de ratones que emplean el sistema LoxP se puede utilizar para apuntar a genes de interés o para conseguir el etiquetado permanente de progenitores ZVS, lo que representa una herramienta útil para estudios de la neurogénesis adulta 21,22.
Imaging RMS neuroblast migración en el cerebro intacto sigue siendo un reto debido a las limitaciones técnicas actuales. Sin embargo, este proceso se puede controlar utilizando el disco confocal hilado time-lapse microscopía de rodajas de cerebro de agudos, que proporcionan una adecuada sistem muy parecidas a las condiciones in vivo también susceptibles a la manipulación farmacológica 23,24. Acoplamiento de electroporación postnatal vivo con time-lapse facilitará la comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la motilidad neuroblastos y contribuir al desarrollo de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eficiente de la migración de células progenitoras neurales a lo largo de los RMS asegura su posterior maduración en neuronas funcionales 10. Corrientes prominentes de progenitores neurales dirigidos hacia el OB son visibles en la infancia humana y es probable que desempeñen un papel importante en el desarrollo del cerebro humano temprano postnatal 27. Por otra parte, estas células son capaces de sitios diana del cerebro afectadas por la lesión y 4,28 neurodegeneración. Ser capaz d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS y YZ son apoyados por KCL y KCL-China becas de doctorado. MO fue financiado por una beca de doctorado de Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Damos las gracias a Masaru Okabe y Jun-ichi Miyazaki para el plásmido PCX-EGFP y Alain Chedotal y Atenea Ypsilanti para consejos valiosos sobre la electroporación.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
Riferimenti
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neuroscienze. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
