Summary

Frühe Metamorphic Insertion Technologie für Fluginsektenverhaltensüberwachung

Published: July 12, 2014
doi:

Summary

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Abstract

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Introduction

Einfügen von Elektroden, auch mit angehängten elektronischen Systemen, um Insekten zur telemetrischen Aufnahme-Anwendungen, hat eine große Methode, wie neuronale Systeme funktionieren bei Naturflug 1 zu verstehen. Der An-oder Einbau künstlicher Systeme in Insekten hat viele Herausforderungen, denen das Potenzial, die natürlichen Flug der Insekten stören gestellt. Oberflächliche Anhang oder chirurgische Einsetzen von künstlichen Plattformen im erwachsenen Insekt ist unzuverlässig wegen der möglichen Verschiebung der eingesetzten Geräte durch Körper-induzierte Trägheitskräfte und Stress verursacht werden. Oberflächlich angebracht oder chirurgisch eingeführt Elektroden anfällig für von den Insekten als Fremdkörper zurückzuweisen sind. Darüber hinaus ist die Implantation erfordert die Entfernung von Schuppen und Haufen rund um den Exoskelett. Der dicke Schuppenschicht muss auch für chirurgische Innervationen, die Sicherheiten Gewebeschäden führen können durchdrungen werden, was mit dem natürlichen Flug der Insekten stören. Alle tiese Faktoren können eine chirurgische oder oberflächliche Implantation eine schwierige und heikle Aufgabe zu machen. Um diese Bedenken in externes Anbringen Steuerung und Sensorsysteme für die Insekten beteiligt zu lindern, wird ein neues Verfahren mit metamorphen Wachstums in diesem Artikel beschrieben werden.

Die Entwicklung der metamorphen holometabolen Insekten beginnt mit der Umwandlung der Larve (oder Nymphe) in einen Erwachsenen mit einem Zwischenpuppenstadium (Abbildung 1). Die Metamorphose Prozess beinhaltet eine umfangreiche Neuprogrammierung Gewebe einschließlich Degeneration gefolgt von Umbau. Diese Transformation macht aus einem terrestrischen Larve zu einem erwachsenen Insekt demonstrieren mehrere komplexe Verhaltensweisen 2,3.

Das Überleben der Insekten nach extremen Parabiose Operationen hat sich gezeigt, wo die Operationen wurden in den frühen Stadien metamorphen 4,5 durchgeführt. Bei diesen Operationen, die Entwicklungs Histogenese caused Operationswunden in kürzere Laufzeiten repariert werden. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde eine neue Technik entwickelt, bei dem die Implantation von elektrisch leitenden Elektroden während der Anfangsphase der metamorphen Wachstum (Fig. 1) durchgeführt. Dies ermöglicht eine sichere Befestigung biomechanisch auf das Insekt 6. Eine sehr zuverlässige Schnittstelle ist auch mit neuronalen und neuromuskuläre Systeme 7 des Insekts gesichert. Diese Technik wird als "Early Metamorphosis Insertion Technology" (EMIT) 8 bekannt.

Nach dem Wiederaufbau der gesamten Gewebesystem, Strukturen in der Puppe gesteckt entstehen mit dem erwachsenen Insekt. Flugmuskelgruppen machen bis zu 65% der Gesamtkörpermasse thorakalen und somit ist eine relativ bequeme Zielscheibe für die EMIT Verfahren 9. Während der Grundflügelschlag, die Veränderungen in der Morphologie des Flugstromversorgung dorsolongitudinal (dl) und dorsoventraler (dv) Muskeln verursachen die Flügel articulatIonen-Geometrie, um den Auftrieb zu erzeugen 10. Deshalb ist die funktionelle Koordination von dl und dv Muskeln hat ein aktives Forschungsgebiet Neurophysiologie unter der Flug gewesen. Tethering Insekten in elektronisch programmiert visuelle Umgebungen wurde für die Untersuchung der Neurophysiologie von komplexen Bewegungsverhalten 11,12 die häufigste Methode. Zylindrische Arenen der Leuchtdiode Platten zusammengesetzt wurden für diese Virtual-Reality-Umgebungen, in denen fliegende Insekten sind in der Mitte angebunden und die Bewegung wird durch die dynamische Aktualisierung die umliegende Panorama-Sichtanzeige simuliert verwendet. Im Falle kleinerer Insekten, wie Fruchtfliege Drosophila wird Anbinden durch Anbringen eines Metallstift auf den dorsalen Thorax der Insekten und Platzieren des Stifts unter einem Dauermagneten 13,14 erreicht. Diese Methode erlaubt nur Quantifizierung der motorischen Reaktionen durch visuelle Beobachtungen mit Hochgeschwindigkeitskameras ohne elektrophysiologische Analysen. Darüber hinaus diese Method ist ineffizient, die größer und schwerer Körper von Manduca sexta auszusetzen. Um dieses Problem zu lösen, profitierten wir von magnetisch schwebende Bilder, bei denen geringes Gewicht Rahmen mit Magneten, ihre Unterseite angebracht werden durch elektromagnetische Kräfte schwebte. Wenn mit handelsüblichen neuronalen Verstärker und LED-Arrays kombiniert, bietet diese eine Plattform, um Flug-Motorleistung zu kontrollieren und erfassen die bezogene Elektrophysiologie des Manduca sexta.

Protocol

HINWEIS: Die Quelle der Materialien und Reagenzien benötigt, um das Protokoll zu folgen ist in der "Reagenzien" Tabelle unten. 1. Vorbereitung Printed Circuit Boards (PCB) für die Aufnahme Elektrodenanschluss HINWEIS: Um eine praktische experimentelle Verfahren bereitzustellen, werden Drahtelektroden auf eine Leiterplatte gelötet, um diese Elektroden in eine FFC (flexible Flachkabel)-Buchse steckt. Schneiden Sie ein 0.5×5 cm 2 S…

Representative Results

Eine schematische Darstellung der Gesamt EMIT-Verfahren ist in Fig. 1 dargestellt, welche die Hauptphasen des hawkmoth der metamorphen Zyklus und den entsprechenden Elektrodeneinführungsschritte. Das Einsetzen der Elektrode sollte in den späten Puppenstadium 4 bis 7 Tage vor dem Schlüpfen durchgeführt werden. Dadurch können die Muskelfasern um die Elektroden zu entwickeln und zu sichern, das Implantat im Insekt. Das typische Ergebnis einer abgeschlossenen spät Einsetze…

Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der chirurgischen Insertion der Aufzeichnungselektroden, die die Fähigkeit, Daten in den späteren Schritten des Protokolls aufzunehmen beeinflussen. Die Aufzeichnungselektroden sollten in der Puppe einen Tag nach der ausstellenden Flügel Flecken auf seiner dorsalen Seite eingefügt werden. Wenn das Einsetzen von zwei oder mehr Tage nach diesem Zeitpunkt durchgeführt wird, wird das Insekt die Gewebe nicht genug Zeit, um sich zu entwickeln und stabilisieren die Elektroden eingeset…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AB dankt der National Science Foundation für die Förderung im Rahmen der Cyber-Physical Systems Programm (1239243) und Division of Undergraduate Education (1245680); und der Defense Advanced Research Project Agency (DARPA) für die Unterstützung der frühen Phasen dieser Arbeit. Die früheren Stadien dieser Arbeit wurde von Prof. AB in Amit Lal Labor an der Cornell University durchgeführt. Dank AB Ayesa Sinha und Prof. Lal für experimentelle Beratung und Ideenfindung in diesem Stadium. Manduca sexta (Linnaeus 1763) wurden aus einer Kolonie von der Abteilung für Biologie an der Duke University, Durham, NC, USA gepflegt erhalten. Motten wurden innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen verwendet. Wir möchten Triangle Biosystems International, vor allem David Juranas und Katy Millay für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung und Nutzung ihrer Neuroware System danken. Wir möchten auch an Will Caffey für seine Hilfe während der Experimente danken.

Materials

Coated stainless steel wire A-M Systems 791900 0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire Litz or inductor wire can be used. 
Surface-mount FFC connector Hirose Connector FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers Grobet USA N/A Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes Kimberly-Clark Worldwide 34155 Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape N/A N/A 5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle Becton Dickinson & Co. 30511 20-30 gauge hypodermic needle can be used. Video showed 30 gauge.
Rigid Fixation Stick N/A N/A Variety of materials can be used (e.g. coffee stirrers)
Insect Emergence Cage N/A N/A Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal Cauterizer Advanced Meditech International CH-HI CT2103 (tip) Optional equipment used for application of dental wax.
Dental Wax Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma N/A Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic Levitation Platform N/A N/A Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping
CA40 Instant Adhesive 3M 62-3803-0330-5 Avoid skin contact. Use gloves when handling.
70% Isopropyl alcohol store brand Commercially available from many suppliers.
PCB Etchant RadioShack 276-1535 Toxic if swallowed or ingested, skin irritant 
EQUIPMENT:
Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
TBSI Neuroware Software Triangle Biosystems International N/A NeuroWare v1.4. Software for importing .nex files obtained at Technologies, N. NeuroExplorer Code and Scripts. (2012).at http://www.neuroexplorer.com/code.html
TBSI Wireless Recording System Triangle Biosystems International W5 FI USB Base station, headstage unit, charger
16 Channel Amplifier A-C Amplifier A-M Systems  950000 Model 3500 (110 V)
Oscilloscope  Agilent Technologies  DSO1014A Oscilloscope, 100 MHz, 4 channel
Microscope N/A N/A 5x magnification microscope to assist visualization during electronics construction. 
Ultrasonic Cleaner ColeParmer EW-08848-10 Ultrasonic Cleaner with Timer, 

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Verderber, A., McKnight, M., Bozkurt, A. Early Metamorphic Insertion Technology for Insect Flight Behavior Monitoring. J. Vis. Exp. (89), e50901, doi:10.3791/50901 (2014).

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