Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino
Summary
Descriviamo qui l’uso di una variante di proteina fluorescente verde sensibile al pH, la pHluorina, per studiare la dinamica spazio-temporale dei recettori di guida dell’assone che trafficano sulla superficie cellulare. Il recettore taggato con pHluorina è espresso sia in coltura cellulare che in vivo, utilizzandol’elettroporazione dell’embrione del pulcino.
Abstract
Durante lo sviluppo, i recettori di guida dell’assone svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della sensibilità degli assoni a segnali attraenti e ripugnanti. Infatti, l’attivazione dei recettori di guida è il primo passo dei meccanismi di segnalazione che consentono alle punte dell’assone, ai coni di crescita, di rispondere ai ligandi. Come tale, la modulazione della loro disponibilità sulla superficie cellulare è uno dei meccanismi che partecipano all’impostazione della sensibilità del cono di crescita. Descriviamo qui un metodo per visualizzare con precisione la dinamica superficiale della cellula spazio-temporale di un recettore di guida dell’assone sia in vitro che in vivo nel midollo spinale del pulcino in via di sviluppo. Abbiamo approfittato della proprietà di fluorescenza dipendente dal pH di una variante di proteina fluorescente verde (GFP) per rilevare specificamente la frazione del recettore di guida dell’assone che è indirizzata alla membrana plasmatica. Descriviamo prima la convalida in vitro di tali costrutti dipendenti dal pH e ne dettagliamo ulteriormente l’uso in vivo,nella corda spinale del pulcino, per valutare la dinamica spazio-temporale del recettore della guida dell’assone di interesse.
Introduction
Durante la loro navigazione, gli assoni integrano più segnali ambientali che li guidano verso il loro obiettivo. Questi segnali attivano recettori di guida sulla superficie dei terminali di axon, i coni di crescita, che a loro volta avviano un’appropriata via di segnalazione. Pertanto, la regolazione temporale e spaziale della distribuzione della superficie cellulare dei recettori è fondamentale per impostare la sensibilità del cono di crescita1. In questo contesto, l’attraversamento della linea mediana da parte degli assoni commissurali è un modello eccellente per indagare la regolazione dei livelli superficiali delle cellule recettoriali. Nel midollo spinale in via di sviluppo, gli assoni commissurali sono inizialmente attratti verso la piastra del pavimento ventrale dove attraversano la linea mediana. Dopo l’attraversamento, perdono la loro reattività agli attrattori della piastra del pavimento e ottengono risposta ai repellenti per piastre del pavimento in modo che possano uscire dalla piastra del pavimento e navigare verso la loro destinazione finale nel lato contralaterale del sistemanervoso 2,3. La regolazione della disponibilità del recettore sulla superficie del cono di crescita è uno dei meccanismi alla base del passaggio di reattività ai segnali della lineamediana 4,5. Pertanto, il monitoraggio selettivo dei recettori presenti nella membrana plasmatica dei coni di crescita è di primaria importanza. Descriviamo qui un metodo basato sulla proprietà di fluorescenza dipendente dal pH di una variante di proteina fluorescente verde (GFP) per visualizzare specificamente i recettori di guida dell’assone che sono indirizzati alla membrana plasmatica in vitro e in vivo,nel midollo spinale del pulcino in via di sviluppo.
Rothman e colleghi progettati da mutazioni puntili varianti sensibili al pH della GFP tra cui la pHluorina eclittica6. La pHluorina eclittica ha la proprietà di essere non fluorescente se esposta al pH acido (<6), pur essendo fluorescente a pH neutro. Ciò consente di distinguere i recettori non fluorescenti localizzati nei compartimenti acidiintracellulari (cioè endosomi, vescicole di traffico) dai recettori fluorescenti incorporati nella membrana plasmatica e quindi esposti al pH neutro extracellulare7. Ne abbiamo approfittato per monitorare la localizzazione della membrana plasmatica della plexinA1, un recettore di guida dell’assone che media la risposta del cono di crescita alla semaphorin repellente della linea mediana 3B5 (Figura 1A). Descriviamo qui la caratterizzazione in vitro di un costrutto pHluorin-plexinA1, insieme all’elettroporazione ovo 8-10 di questo costrutto nel midollo spinale del pulcino in via di sviluppo seguito dall’analisi microscopica delle criosezioni che consentono di seguire la dinamica del recettore della guida dell’assone in vivo con risoluzioni spaziali e temporali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per seguire la dinamica di un recettore di guida dell’assone sia nella coltura cellulare che nel contesto dello sviluppo del midollo spinale dell’embrione del pulcino.
Per progettare una proteina etichettata con pHluorina de novo, è necessario considerare due punti per quanto riguarda la strategia di clonazione. In primo luogo, l’etichetta pHluorina deve essere esposta al lume degli endosomi acidi e, di conseguenza, al compartiment…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas per il loro aiuto. Questo lavoro è supportato da CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B e A.J sono supportati rispettivamente da borse di studio La Ligue contre le cancer e Labex DevWeCan.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
Riferimenti
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochimica. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
