Summary

تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

Published: November 18, 2013
doi:

Summary

حصاد الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار تتزايد استخدامها في تطبيقات تتراوح بين البحوث الأساسية لتطوير النظام العصبي لاستكشاف التطبيقات السريرية المحتملة في مجال الطب التجديدي. وهذا يجعل رقابة صارمة في ظروف العزلة وزراعة المستخدمة لزراعة هذه الخلايا حاسمة لصوت النتائج التجريبية.

Abstract

يوضح العمل الأخيرة التي الجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد وتكون الأورام ينطوي السكان من الخلايا الجذعية (المنبوذة) المقيم في الدماغ الكبار. ومع ذلك، فإن آليات هذه الخلايا عادة هادئة توظف لضمان حسن سير العمل في الشبكات العصبية، فضلا عن دورها في التعافي من الإصابة والتخفيف من عمليات الاعصاب مفهومة قليلا. هذه الخلايا الموجودة في المناطق المشار إليها باسم "منافذ" التي توفر بيئة مكتفية التي تنطوي على إشارات تغييري من كل من الأوعية الدموية وجهاز المناعة. العزلة، والصيانة، والتفريق بين الطوائف المنبوذة CNS في ظل ظروف ثقافة المعرفة التي تستبعد العوامل غير معروف، يجعلها في متناول العلاج بالوسائل الدوائية أو وراثية، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة سلوكهم في الجسم الحي. هنا نقدم معلومات مفصلة عن طرق لتوليد ثقافات المنبوذة CNS من مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ونهج لتقييم د بهمifferentiation المحتملة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes في المختبر. هذه التقنية تعطي السكان خلية متجانسة بوصفها ثقافة أحادي الطبقة التي يمكن أن تصور لدراسة الفردية المنبوذة وذريتها. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها عبر أنظمة مختلفة نموذج حيواني والعينات السريرية، التي كانت تستخدم في السابق للتنبؤ ردود التجدد في الكبار الجهاز العصبي التالفة.

Introduction

العقيدة المركزية لعلم الأعصاب، التي وضعتها الملاحظات الأساسية للالتهندس الخلوي الدماغ التي أدلى بها رامون كاجال Y. منذ أكثر من قرن، رأت أن من غير المرجح تكوين الخلايا العصبية بعد المراهقة نظرا لتعقيد الشبكات العصبية الموجودة في الجهاز العصبي المركزي 1. على الرغم من عمل التمان في 1960s، وبعد كابلان، مما يدل على أن 3 H-ثيميدين يمكن العثور عليها في الخلايا العصبية الناضجة مشيرا إلى أنه في الواقع يجري إنشاؤها الخلايا العصبية في مناطق متميزة من الدماغ الكبار، واصل العقيدة لعقد 2، 3. واصلت الأدلة لجبل مع البحث نوتيبوم التي تصف التغيرات الموسمية في عدد الخلايا العصبية الموجودة في أدمغة الطائر المغرد 4. لم يكن حتى عام 1999، عندما جولد وآخرون. الأعمال المنشورة على جيل من الخلايا العصبية في قرن آمون مع الزيادات أداء مهام التعلم النقابي في الفئران، فضلا عن ملاحظات Kornack والبرهان راكيتشواصلت تينغ تكوين الخلايا العصبية في المكاك الكبار أن مفهوم الدماغ أقل صرامة وأكثر من البلاستيك، واعترف 5، 6.

البحث عن مصدر الخلوية لهذه العصبونات ولدت من جديد يؤدي إلى اكتشاف عدد سكانها منفصلة من الخلايا الجذعية (المنبوذة) التي تتواجد في مناطق من الدماغ ويشار إلى الكوات 7. وتعتبر منطقة ومنطقة الحبيبية subventricular الفرعية الحصين أن تكون المنطقتين العصبية الرئيسي 8،9. خلايا معزولة من هذه المواقع عرض مميز الكلاسيكية المنبوذة المستمدة الجنينية أو الجنين، وتجديد الذات والتمايز المحتملة. في حالة الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، فإنها يمكن أن تكون متمايزة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. بالإضافة إلى ذلك، هذه وصمة عار المنبوذة إيجابية للعلامات الجنين مجلس الأمن القومي مثل البروتين وسيطة خيوط nestin 10. يسلط الضوء على المزيد من العمل الأخيرة التي المنبوذة قد لا تقتصر على هذه رالتعليم الجامعي المجالات، ويتم في الواقع المترجمة في جميع أنحاء الدماغ كما يبلغ عدد سكانها هادئة إلى حد كبير من الخلايا المرتبطة بشكل وثيق مع الأوعية الدموية 11.

الملاحظات التي يتم تعبئتها المنبوذة في استجابة لإصابة يشير إلى احتمال أن تكون قادرة على الاستفادة من هذه الخلايا لأغراض التجديدي للمساعدة في التعافي من اضطراب الاعصاب والسكتة الدماغية 12، 13. هذا هو لا يختلف عن الدور الذي تلعبه الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) في شفاء الأنسجة الضامة، والتي توجد الخلايا المحيطة بالأوعية كما أن لديها القدرة على أن تصبح بانيات، غضروفية، والخلايا الدهنية 14. ومع ذلك، NSCs لا يمكن حصادها في بنفس الطريقة اللجان الدائمة من نخاع العظام بواسطة طموح الروتينية وكثافة تقنيات الطرد المركزي التدرج والاستفادة منها لاحقا في علاجات الخلايا استنادا ذاتي. ونتيجة لذلك، ومصادر أخرى من الخلايا، مثل استخدام NSCs الجنين أو السلائف الخلايا العصبية المشتقة من الإدارة الانتخابيةالخلايا الجذعية ryonic تم استكشاف نطاق واسع في الأمراض الحيوانية ونماذج إصابة بدرجات متفاوتة من النجاح 15. تقنيات الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها استخدام مصادر خلية جسدية تقدم سبيلا محتملا آخر لإنتاج العلاجات المستندة إلى الخلايا مفيدة علاجيا لمجموعة واسعة من التطبيقات، والتغلب على محدودية والمخاوف الأخلاقية بشأن استخدام الخلايا الجنينية والأنسجة الجنينية 16. ومع ذلك، فقد ثبت الترجمة السريرية لهذه النتائج أن يكون مهمة صعبة، كما هو موضح في نضالات علاج الحالات العصبية المختلفة مع العلاجية استنادا SC-النهج 17،18، فضلا عن مسار متعرج لإزالة التنظيمية. كنهج بديل، يمكن إدخال العلاجات الدوائية محددة تعدل أرقام مجلس الأمن القومي وتسهيل الانتعاش في نماذج من مرض الشلل الرعاش والسكتة الدماغية 19. مهما كانت الاستراتيجية قد يكون، فهم كيفية التعامل مع هذه الخلايا بشكل فعاليتطلب النظام في المختبر يمكن الوصول إليها.

ثقافات NSCs لا يمكن أن يؤديها إما الثقافات الكلي، المعروف أيضا باسم neurospheres، أو على شكل أحادي الطبقة 8،20. وقد استخدمت على نطاق واسع على حد سواء التقنيات، مما يتيح لتهيئة الظروف ثقافة محددة، أي استخدام عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) أو عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) كمصدر mitogen، التي تنص على توسيع السلائف متعددة القدرات. بينما الثقافات neurosphere قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة إمكانية نشر نسيلي من نوع من الخلايا المعزولة، وقد تبين هذا النظام لإنتاج يسكنها خليط من الخلايا خلال التوسع 21. بالإضافة إلى ذلك، بنية مغلقة من neurospheres يجعل التلاعب الدوائية من خلايا غير عملي، ويمكن أن يكون مرتبك تفسير تأثير هذه العوامل قد يكون بسبب المكروية التي أنشئت داخل neurosphere نفسها. الثقافات أحادي الطبقة، من ناحية أخرى، يمكن أن يكونالمستخدمة في شاشات إنتاجية عالية من مكتبات جزيء صغير، وتوفير أداة قوية لاستكشاف آليات نقل الإشارة التي تنظم نمو وتمايز SC ويفتح الفرصة لاكتشاف مركبات جديدة تستهدف تحديدا هذه الفئة من السكان الخلية.

ونتيجة لذلك، والقدرة على توليد بتكاثر ثقافات NSCs الكبار من مناطق مختلفة من الاهتمام في الدماغ يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية، بدءا من الدراسات التنموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) لاستكشاف نهج الطب التجديدي رواية . بروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية تشريح وتقييم إمكانية التفريق بين الطوائف المنبوذة CNS المعزولة من الدماغ القوارض الكبار.

Protocol

العمل تتمسك إعلان Helsinski وبيان الحيوان ARVO. واستخدمت الحيوانات لجمع الأنسجة وتم اتباع جميع أساليب ذات الصلة وفقا للتعليمات للمنشأة الحيوان في جامعة درسدن. وقد تم التعامل مع الحيوانات، ويضم وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية الألمانية للاستخدام ورعاية الحيوانات المختب…

Representative Results

تحديد المنطقة ذات الاهتمام التي لحصاد الخلايا الجذعية العصبية هو خطوة أولى حاسمة وستحدد مقدار الوقت المستغرق للحصول على لوحة متكدسة من الخلايا. على سبيل المثال، هي منطقة SVZ العصبية الكلاسيكية ويحتوي على نسبة أعلى من نسبة الخلايا الجذعية العصبية لذلك. ومع ذلك، فإن تق…

Discussion

ويجري تقاسم العديد من الخطوات الحاسمة لنجاح العزلة، والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار من القواسم المشتركة مع تقنيات زراعة الأنسجة القياسية. الهدف أن نضع في الاعتبار هو أن NSCs معزولة عن الدماغ الكبار يجب أن نحافظ على أكبر عدد ممكن من هذه الخصائ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل (جزئيا) من قبل التحالف هيلمهولتز ICEMED – التصوير والأمراض الاستقلابية علاج البيئة، من خلال صندوق مبادرة وشبكة جمعية هيلمهولتز، منحة من مؤسسة أخرى Kroener-فريزينيوس، ومنحة من جمعية الألمانية للبحوث ( SFB 655: خلايا في الأنسجة).

Materials

6-well tissue culture dishes BD Biosciences 353934
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P-3655

5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C).

Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).

Fibronectin R&D Systems 1030-Fn Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus Corning Life Sciences 430769
DMEM/F-12 Mediatech 10-090-CV See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin Sigma-Aldrich T-2036
Insulin Sigma-Aldrich I-0516
Putrescine Sigma-Aldrich P-5780 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S-5261 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate Buffered Saline Mediatech 21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) R&D Systems 233-FB Working concentration 20 ng/ml 
Delta4 (Dll4) R&D Systems 1389-D4 Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2) R&D Systems 623-AN Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor Calbiochem 420099 Working concentration 200 nM 
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A-2058
15- and 50-ml Conical tubes Corning Life Sciences 430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
[header]
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15719
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma-Aldrich D-9663
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D-8417 5 mg/ml stock solution in methanol
[header]
Primary Antibody Table
Nestin Chemicon MAB353

Dilution Factor: 1:400

Species: Mouse IgG1

Hes3 Santa Cruz sc-25393

Dilution Factor: 1:100

Species: Rabbit IgG

Sox2 R&D Systems MAB2018 

Dilution Factor: 1:100

Species: Mouse IgG2a

CNPase Chemicon MAB326

Dilution Factor: 1:200

Species: Mouse IgG1

β-tubulin III (TUJ1) R&D Systems MAB1195

Dilution Factor: 1:500

Species: Mouse IgG2a

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako North America Z0334

Dilution Factor 1:500

Species: Rabbit

[header]
Secondary Antibody Table
Alexa   568 Invitrogen A-21124

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Mouse IgG1

Alexa 488 Invitrogen A-21131

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Mouse IgG2a

Cy5 Jackson ImmunoResearch 59883

Dilution Factor: 1:200

Species: Goat anti Rabbit

Riferimenti

  1. Cajal, R. Y. . Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , (1899).
  2. Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
  3. Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197, 1092-1094 (1977).
  4. Nottebohm, F. Neuronal replacement in adulthood. Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).
  5. Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. Neurogenesis in the neocortex of adult primates. Science. 286, 548-552 (1999).
  6. Kornack, D. R., Rakic, P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).
  7. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).
  8. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  9. Luskin, M. B. Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone. Neuron. 11, 173-189 (1993).
  10. Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 60, 585-595 (1990).
  11. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).
  12. Jin, K., et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).
  13. Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone. Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).
  14. Caplan, A. I. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J. Pathol. 217, 318-324 (2009).
  15. Goldman, S. Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system. Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).
  16. Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications. Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).
  17. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, e1000029 (2009).
  18. Lindvall, O., Bjorklund, A. Cell therapeutics in Parkinson’s disease. Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).
  19. Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease. Mo.l Neurobiol. , (2012).
  20. Cattaneo, E., McKay, R. Identifying and manipulating neuronal stem cells. Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).
  21. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
  22. Duarte, A., et al. Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development. Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).
  23. Maisonpierre, P. C., et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science. 277, 55-60 (1997).
  24. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  25. Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. Neuron. 5, 297-306 (1990).
  26. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  27. Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons. Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).
  28. Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain. J. Neuroinflammation. 6, 39 (2009).
  29. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells. PLoS One. 5, e9414 (2010).
  30. Park, D. M., et al. Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics. Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).
  31. Poser, S. W., Shostak, S., et al. Ch. 5. Cancer Stem Cells – The Cutting. , 89-110 (2011).
  32. Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).

Play Video

Citazione di questo articolo
Poser, S. W., Androutsellis-Theotokis, A. Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain. J. Vis. Exp. (81), e50880, doi:10.3791/50880 (2013).

View Video